论文摘要
头颈部鳞状细胞癌（Head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC）在全世界范围内每年约有500万病例被确诊，约占全部肿瘤病例的6％。在过去的20年里，随着诊断、外科手术、放射治疗和化学药物治疗技术水平的提高以及治疗方案的成熟，头颈部鳞癌患者的死亡率已有所降低，但其5年生存率仍仅有40%-50%。术后高复发率及高转移率是影响头颈部鳞癌患者生存率最主要的两个因素。因此，研究头颈部鳞癌转移中相关的信号转导通路将有助于提高对本病的治疗。DDR2（Discoidin domain receptor2）是一种受体酪氨酸激酶（Receptor tyrosinekinase, RTK），可以被多种胶原激活（I-III型）。DDR2特异性的参与一系列肿瘤生物学行为，包括调控血管内皮生长因子的表达、肿瘤血管生成、肿瘤侵袭和转移。基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases, MMPs）是DDR2通路中一组主要的下游靶基因。上皮间质转变（EMT）在头颈部鳞癌转移中发挥重要作用，它主要通过促进原发性肿瘤细胞发生形态学改变，减弱细胞与细胞间连接，从而有助于细胞穿透各种屏障而加速肿瘤的侵袭和迁移，而DDR2是一种调控EMT的关键性因素。因此我们推测DDR2可能是一个新的癌基因。至今为止有关DDR2在头颈部鳞癌中相关功能的研究未见明确报道，本研究目的与意义是探讨DDR2基因在头颈部鳞癌发病机制中的作用，确定DDR2基因的功能，为头颈部鳞癌的防治提供理论依据。为了明确DDR2在头颈部鳞癌中的作用，我们首先检测了DDR2在头颈部鳞癌及癌旁组织标本中的表达。qPCR结果显示癌组织标本中DDR2的mRNA表达量明显高于其对应的癌旁正常组织，并随着肿瘤等级的升高而升高。通过免疫组化及免疫印迹技术，我们观察到了相同的结果。在免疫组化结果中，DDR2表达阳性率及表达强度与患者肿瘤等级及淋巴结转移相关，与患者年龄和性别无关。上述结果强烈提示我们在头颈部鳞癌中，DDR2可能是一种高等级及高转移鳞癌的标记物。临床证据显示高等级HNSCC在获得高转移潜能时往往伴随着E-cadherin的表达丧失及vimentin的表达上升。因此，我们选取四种HNSCC细胞系Tca8113、TB cells、SCC25和FaDu，同时运用qPCR及免疫印迹技术检测其E-cadherin和vimentin的表达，结果显示相对于Tca8113及TB细胞，SCC25和FaDu细胞高表达E-cadherin，而vimentin几乎不表达。这与上述细胞之前的报道相吻合，提示Tca8113及TB细胞具有高转移特性，而SCC25和FaDu细胞则倾向于上皮样细胞。与此同时，DDR2表达水平检测结果显示其在Tca8113及TB细胞中明显高于SCC25和FaDu细胞，提示DDR2与HNSCC细胞的转移潜能具有直接相关性。为了全面理解DDR2在HNSCC细胞系生物学行为中的作用，我们通过外源性腺病毒过表达DDR2来观测其对细胞增殖、侵袭和迁移的影响。MTT细胞生长曲线、EdU测细胞增殖及细胞周期结果均显示无明显差别。Transwell及划痕实验结果显示过表达DDR2明显促进了HNSCC细胞的侵袭和转移，并且在细胞予以I型胶原几次后，这种作用被明显放大。鉴于细胞侵袭实验主要依靠MMP2和MMP9的分泌水平，我们运用免疫印迹检测两者的表达水平，结果显示过表达DDR2显著提高了MMP2和MMP9的表达水平。同时，我们通过小干扰RNA技术沉默DDR2在高表达内源性DDR2的TB细胞中重复上述实验，结果显示，DDR2沉默后明显降低了TB细胞的侵袭和迁移力。通过上述结果，我们可以假设DDR2在HNSCC细胞中的生物学功能主要为促进肿瘤细胞的侵袭和转移。在肿瘤发展过程中，EMT主要参与肿瘤细胞局部侵袭、扩散和转移。越来越多的证据显示DDR2是一种间充质细胞标记物以及EMT的关键性调控因子。这些确定的理论促使我们去确认DDR2是否参与了HNSCC细胞的EMT转变。细胞镜下观察结果显示与对照组相比，过表达DDR2对细胞形态无明显改变，同时免疫荧光及免疫印迹结果显示过表达DDR2对EMT标记性蛋白质E-cadherin和vimentin的表达无明显改变。在体内环境中，缺氧是触发肿瘤细胞发生EMT转变及转移的一种重要因素，因此我们接下来检测了在缺氧环境下DDR2是否参与了HNSCC细胞的EMT转变。细胞镜下观察结果显示过表达DDR2明显提高了HNSCC细胞的EMT转变，免疫荧光及免疫印迹结果显示过表达DDR2组细胞E-cadherin表达水平明显降低，同时伴随着vimentin表达水平的明显升高。通过上述结果，我们推测在HNSCC细胞中，DDR2参与EMT的转变可能部分的需要缺氧因素的介入。DDR2对HNSCC细胞生物学行为的体外调控作用在体内是否与其一致呢？接下来的实验，我们运用裸鼠皮下荷瘤及尾静脉注瘤肺部转移模型来验证这个疑问。结果显示过表达DDR2对肿瘤瘤体形成及肿瘤生长均无明显作用。肺是肿瘤细胞经尾静脉注射后首先接触的毛细血管床，因此我们检测了DDR2在HNSCC细胞肺转移中的作用。肺表面转移结节观察及统计以及肺组织切片HE染色结果显示过表达DDR2明显促进了HNSCC细胞肺转移进程。同时肺组织转移瘤免疫组化结果显示过表达DDR2显著提高了MMP2和MMP9的表达水平。上述结果提示DDR2在HNSCC细胞肺转移进程中发挥重要作用。综上所述，我们首次发现了在HNSCC中，DDR2作为一种促癌基因促进了癌细胞侵袭和转移。由于局部侵袭和颈部淋巴结转移是HNSCC的显著性特征，DDR2可能作为治疗HNSCC的一个重要靶点。