白血病多药耐药性及其逆转的研究

论文摘要

研究目的1．了解P糖蛋白（Pgp）、多药耐药基因（mdr1）、多药耐药相关蛋白基因（MRP）和DNA拓扑异构酶Ⅱ（TopoⅡ）是否为急性白血病临床耐药的预后因素。2．确定Pgp、mdr1、MRP和TopoⅡ诊断急性白血病临床耐药的准确性。3．研究发夹状小分子干扰RNA（hairpin siRNA）对白血病多药耐药细胞株K562／A02 mdr1和GSTπ基因的表达和功能的影响。研究方法1．45例急性白血病患者用单抗UIC2标记的流式细胞仪法测定Pgp；用RT-PCR方法检测其mdr1、MRP和TopoⅡ的表达，用单因素和多因素Logstic回归分析它们与白血病预后的关系。2．以临床耐药作为金标准，用受试者工作特征（ROC）曲线下面积评价上述参数的准确性；在ROC曲线上确定各种参数的最佳临界点；为了提高这些参数的诊断价值，采用平行试验和系列试验计算其诊断临床耐药的灵敏度（Se）和特异度（Sp）。3．根据mdr1 mRNA第79-99和GSTπmRNA第308-327核苷酸为作用靶点，合成针对靶区域序列的发夹状siRNA，克隆入pSilencer2．1-U6 neo，克隆产物为pSilence-mdr1和pSilence-GSTπ，转染K562／A02细胞株。用实时荧光定量PCR检测K562／A02 mdr1和GSTπmRNA的表达；用Westernblot和荧光免疫组化观察Pgp和GSTπ蛋白的表达；MTT法检测阿霉素对K562／A02细胞半数抑制浓度(IC50)。研究结果：1．耐药组Pgp、mdr1、MRP阳性率均高于敏感组（P＜0．01），而TopoⅡ耐药组较低（P=0．049）。经单因素Logistic回归分析，Pgp、mdr1、MRP的过度表达，TopoⅡ的表达降低和55岁以上年龄组与临床耐药性显著相关；性别、发病时WBC、FAB亚型和骨髓原+（早）幼细胞比例与耐药性无关。多因素Logistic回归分析经以上变量校正后显示Pgp、mdr1、MRP、TopoⅡ和年龄仍与耐药性显著相关：Pgp（RR=14．87，P=0．003）；mdr1（RR=19．98，P=0．003）；MRP（RR=16．53，P=0．006）；TopoⅡ（RR=0．23，P=0．046）；年龄（RR=10．87，P=0．013）。将36例初发急性白血病患者单独分析，结果发现Pgp、mdr1和MRP亦与完全缓解密切相关。Pgp（RR=9．8，P=0．005）；mdr1（RR=12．1，P=0．005）；MRP（RR=33，P=0．002）。直线相关分析发现在所有病例组和临床耐药组中Pgp和mdr1；Pgp和MRP：mdr1和MRP具有相关性（P＜0．001）。2．ROC曲线下面积(AUCROC)：TopoⅡ明显低于Pgp、mdr1和MRP（P＜0．05），而Pgp、mdr1和MRP的ROC曲线下面积差别无显著意义（P＞0．05）；Pgp、mdr1、MRP和TopoⅡ的最佳临界点分别为10％、0．8、1．0和0．9，在对应的灵敏度中，Pgp最高为74％，特异度中mdr1最高为86％；Pgp、mdr1和MRP的平行试验和系列试验计算，灵敏度和特异度均可提高至91％。3．经pSilence-mdr1转染后的K562／A02细胞株mdr1 mRNA表达量下降了71．5％，从（2．8±1．65）×108拷贝／μgRNA下降至（3．9±2．37）×107拷贝／μgRNA，（P＜0．01）；同时pSilence-GSTπ作用后，K562／A02 GSTπmRNA表达量较mock下降了39．8％，从（2．3±1．14）×105拷贝／μgRNA下降至（5．4±2．45）×104拷贝／μgRNA（P＜0．01）。4．Western blot结果显示pSilence-mdr1和pSilence-GSTπ分别转染K562／A02细胞株后与mock相比，Pgp和GSTπ的表达明显下降；而pSilence-mdr1和pSilence-GSTπ对α-tubulin的表达没有影响；K562／A02细胞株转染pSilence-laminA／C后与mock相比，laminA／C的表达明显下降，但对Pgp和GSTπ的表达没有作用；灰度扫描显示与内对照B-actin的比值，Pgp的表达量从K562／A02（mock）的0．75±0．019下降到K562／A02（pSilence-mdr1）的0．48±0．049（P＜0．001）；GSTπ的表达量从K562／A02（mock）的0．54±0．025下降到K562／A02（pSilence-GSTπ）的0．39±0．022（P＜0．01）。荧光免疫组化结果显示荧光显微镜下可见Pgp在K562／A02组有大点状的绿色荧光，阳性细胞比例从转染前的71．25±9．65％到pSilence-mdr1转染后的35．25±5．97％（P＜0．001）；GSTπ在K562／A02组有多量点状的红色荧光，阳性细胞从转染前的81．25±6．49％下降到pSilence-GSTπ转染后的41．25±4．43％（P＜0．001）。5．MTT结果示对阿霉素的耐药指数从空载体转染后的23，到pSilence-mdr1转染后的8和pSilence-GSTπ转染后的10，差别有显著性。研究结论：1．Pgp、mdr1、MRP和TopoⅡ是急性白血病临床耐药的独立预后因素。mdr1和MRP具有相关性。2．Pgp、mdr1和MRP诊断临床耐药价值较高；其联合试验可以提高灵敏度和特异度。3．siRNA可有效、特异地逆转K562／A02 mdr1和GSTπ的多药耐药性。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 急性白血病患者Pgp、mdrl、MRP和Topo Ⅱ表达及其与预后关系的临床流行病学研究
• 引言
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 发夹状siRNA逆转K562/A02多药耐药性的研究
• 引言
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 综述
• 英文缩写和简写注释
• 致谢
• 在校期间获得的成果和发表的文章