论文摘要
背景青海省位于“世界屋脊”青藏高原的东北部,全省平均海拔在3000米以上。作为内陆省份,青海省分别与西藏、新疆、甘肃省和四川省相邻,地理位置极其重要,素有“天河锁钥”、“海藏咽喉”之称。青海省面积约为72万平方千米,地域广大,地理景观复杂,媒介生物及媒介传播性疾病种类较多。已有研究显示,青海省存在鼠疫、斑疹伤寒、布鲁氏杆菌病、莱姆病等多种经媒介传播的细菌性传染病。此前,青海省一直未开展过蚊传虫媒病毒调查。近年来,青海省夏秋季存在不明原因发热病例增多,病因不清,是否与病毒感染有关亟待研究。流行性乙型脑炎（以下简称“乙脑”）是我国主要的蚊传虫媒病毒疾病,但是自1950年代以来,青海省一直没有乙脑病例报告,被认为是非乙脑流行区。而与青海省相毗邻的四川省和甘肃省历年来均有乙脑病例的报道,因此不能排除青海省存在流行性乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus, JEV）或其他蚊传虫媒病毒及相关疾病的可能性。随着我国西部大开发战略的推进和青藏铁路的建成通车,青海省进一步成为连接中国内陆与西藏甚至南亚各国的重要陆路交通要道。这对于推动青海省等西部地区经济发展发挥重要作用；同时随着贸易、旅游等迅速发展,物质和人员交流日益增加,也增加了各种媒介性传染病传入或传出的机会。因此在青海省开展蚊虫和蚊传虫媒病毒相关研究势在必行。目的本课题通过在青海省进行系统的蚊虫和蚊传虫媒病毒研究,掌握当地有关蚊虫媒介及蚊传虫媒病毒种类与分布的本底信息；在此基础上重点研究新分离病毒在当地人群和动物中自然感染状况以及与当地感染性疾病的关系及相关疾病的临床特点和流行病学特征,为当地蚊传虫媒病毒疾病的预防与控制提供科学依据。方法2007-2009年连续三年选择夏季在青海省采集蚊虫标本,同时采集健康人群、家养动物和发热病人血清标本。蚊虫标本置于液氮保存,血清标本置于超低温冰箱保存,采用干冰保存运送至实验室。蚊虫标本经研磨离心后,取上清接种组织细胞进行培养,阳性分离物采用血清学和分子生物学方法进行系统鉴定。针对新分离病毒特异性基因片段进行扩增测序,使用ClustalX 1.83、MegAlign、Mega 4和Genedoc 3.2等生物信息学软件进行病毒核苷酸和氨基酸序列比对及系统进化分析。健康人群和家养动物血清标本,采用IFA方法检测新分离病毒IgM和IgG抗体；IFA检测阳性的标本,采用空斑减少中和试验检测病毒中和抗体滴度。发热病人血清标本,采用IFA方法检测新分离病毒IgM抗体,对IgM抗体阳性者继续采集恢复期血清,并定期随访,明确疾病的进程及转归；采用空斑减少中和试验检测病人急性期和恢复期血清是否存在病毒中和抗体滴度4倍及以上增高；采用巢式PCR检测病人急性期血清标本中病毒核酸；采用乳鼠接种法对病毒核酸阳性标本进行病毒分离。结果1、蚊虫媒介分布。本研究于2007-2009年连续三年在青海省采集蚊虫标本,在格尔木市、西宁市、民和县和刚察县设立12个采集点,共采集蚊虫标本23608只（其中2007年采集蚊虫8147只,2008年采集7838只,2009年采集7623只）,经鉴定分为3属10种,其中伊蚊属7种：屑皮伊蚊、背点伊蚊、黄背伊蚊、里海伊蚊、黑头伊蚊、刺扰伊蚊、未分类伊蚊；库蚊属2种：凶小库蚊、淡色库蚊；按蚊属1种：为最黑按蚊。四个地区的蚊种构成和优势蚊种存在明显差异,其中格尔木市的优势蚊种为屑皮伊蚊（29.32%,2523/8604）；西宁市为刺扰伊蚊（84.47%,4225/5002）；民和县为凶小库蚊（32.80%,2448/7463）；刚察县为黄背伊蚊（98.03%,2489/2539）。虽然在青海省连续三年开展蚊虫分布调查,但是一直未采集到JEV的主要传播媒介——三带喙库蚊,这与青海省历年来没有乙脑病例报告的情况一致。此外,本研究连续在青海省民和县采集到最黑按蚊,这是中国首次在高纬度和高海拔地区关于最黑按蚊的报道。2、病毒分离鉴定。采用组织细胞培养法,将23 608只蚊虫标本按照蚊种和采集时间地点分479批进行病毒分离,经过连续3次传代,共得到19株阳性分离物。血清学鉴定显示,其中2株能够与布尼亚病毒属特异性抗体和Tahyna病毒（Tahyna virus, TAHV）原型株Bardos 92特异性抗体发生反应；1株能够与辽宁病毒（Liaoning virus, LNV）特异性抗体发生反应；其余16株与常见虫媒病毒抗体均不发生反应。分子生物学鉴定结果显示,2株为TAHV,1株为LNV,2株为环状病毒,14株为淡色库蚊浓核病毒（Culex pipiens pallens densovirus, CpDNV）。分子遗传进化分析显示,TAHV青海省新分离株独立于欧洲分离株和中国新疆分离株之外,表明青海省新分离TAHV具有明显的遗传进化特征。由于TAHV是欧洲流行最为广泛的致人疾病的布尼亚病毒,且该病毒为我国新近分离病毒,故本课题将对TAHV青海新分离株进行重点研究,并着重于TAHV在当地的感染状况及致病性的系统研究。3、病毒表型和分子特征研究。针对青海省新分离TAHV QH07060病毒系统开展病毒生物学表型和分子特征研究。QH07060病毒在BHK-21细胞上存在两种空斑形态的变异株,分别命名为QH07060-LP（大斑）和QH07060-SP（小斑）病毒。生长动力曲线显示,QH07060-LP病毒感染BHK-21细胞42h达到复制高峰,峰值滴度为9.04 1g PFU/m1；QH07060-SP病毒复制高峰亦为42h,峰值滴度为6.70 1g PFU/ml。乳鼠生存曲线显示,QH07060-LP和QH07060-SP病毒对乳鼠的全部致死时间分别为4d和6d,且QH07060-LP病毒对乳鼠从开始致病到全部致死的过程较短。全基因组测序表明,QH07060-LP和QH07060-SP病毒全基因组序列长度均为12 260nt,共存在9个核苷酸差异位点,并导致6个保守氨基酸位点发生改变；提示这些氨基酸位点的改变可能是引起QH07060病毒空斑表型和生物学差异的分子基础。4、健康人群TAHV感染状况。2007年7-9月和2008年7-9月,在青海省格尔木市、西宁市和民和县共采集健康人血清标本1078份。IFA检测和空斑减少中和试验显示,青海省健康人群IgG抗体阳性率为1.76%（19/1078）；中和抗体阳性率为2.13%（23/1078）。从地区分布看,格尔木市TAHV抗体阳性率明显高于西宁市和民和县,呈现明显的区域分特征。按年龄特征分析,TAHV抗体阳性标本均来自30岁以下人群,其中IgG和中和抗体阳性均以20-29岁年龄组最高,且抗体阳性率均为4.35%（4/92）。结合青海省格尔木市于2007年分离到TAHV,并青海省健康人群中TAHV抗体阳性者主要集中在格尔木市,提示当地存在TAHV感染。5、家养动物TAHV感染状况。2008年7-9月,在青海省格尔木市、西宁市和民和县共采集240份家养动物血清,动物种类包括羊、牛、猪。检测结果显示,青海省家养动物TAHV IgG抗体阳性率为9.17%（22/240）,其中格尔木市抗体阳性率最高,为18.3%（11/60）,明显高于其他两个地区（χ2=7.969,P<0.05）。因此我们将研究重点放在格尔木市,于2009年7-9月再次采集家养动物血清标本,并将动物种类扩大为羊、牛、猪、兔、鸡、鸭,共采集血清标本364份。检测结果显示,格尔木市家养动物TAHV IgG抗体阳性率为11.5%（42/364）,其中兔子的抗体阳性率最高,为38.0%（5/13）,提示兔子等动物可能在当地TAHV自然循环过程中发挥重要作用。6、TAHV与当地发热性疾病的关系。鉴于国外研究报道人类感染TAHV后出现程度不等的发热,为明确TAHV感染与当地疾病的关系,2009年7-9月在青海省格尔木市、西宁市、民和县收集各医院以发热为主诉的病例临床症状信息和血清标本,并着重在格尔木市开展病例搜索和随访调查。调查区域以格尔木市新华村（2007年青海省TAHV分离地）为中心,向东西两个方向扩展共涉及6个村镇,调查面积大约240平方千米（40千米×6千米）。每天在上述村镇医院巡回收集病例信息和采集急性发热病例标本,并在当地疾病控制中心建立TAHV感染的特异检测条件,每天检测收集的血清标本中TAHV IgM抗体。现场调查工作结束后,将所有采集的标本在北京的实验室进行重复检测,以保证检测结果的准确性。调查及实验室检测结果显示,青海省发热病人急性期血清标本TAHV IgM抗体阳性率为3.17%（21/661）；并且在TAHV IgM抗体阳性发热病人双份血清存在TAHV中和抗体4倍及以上增高；发热病人急性期血清标本中检测到TAHV核酸。通过实验室检测确认TAHV感染病例的临床症状主要包括发热、全身不适、头痛、呼吸道症状和消化道症状等,一般症状较轻微；病例随访调查发现,所有病例的临床症状在2-5天全部消失,经过连续3个月的随访未发现严重病例和/或死亡病例。结论本课题通过连续三年的系统研究,明确了青海省蚊虫种类分布的本底信息,发现当地不同地理环境的蚊种构成和优势蚊种存在较大差异；通过组织细胞培养法从采集的蚊虫标本中分离到TAHV、LNV、环状病毒、CppDNV等19株病毒,均为我国青藏高原地区首次分离；在当地居民和家养动物血清中检测到TAHV抗体,且格尔木市抗体阳性率明显高于其他两个地区；通过病例调查和实验室确认,首次在格尔木市发热病人中发现TAHV感染病例。本研究首次证实我国存在TAHV现症感染病例,这是我国除乙脑、登革热之外的第三种蚊传虫媒病毒病。