论文摘要
背景:日光中的紫外线（UV）,主要为长波紫外线（UVA）和中波紫外线（UVB）,是导致皮肤日晒伤、光老化及皮肤癌的重要因素。UVA能穿透皮肤到达真皮深层,引起免疫抑制,并能介导自由基对DNA的损伤。UVB照射可导致细胞DNA损伤及突变频率增加,自由基及活性氧的形成,局部及系统免疫抑制。在相同剂量下,UVB的光损伤作用比UVA约大800～1000倍。以往认为黑素瘤的形成主要与UVA相关,但近年来越来越多的流行病学数据和动物实验提示UVB照射与黑素瘤的发生发展密切相关。UVB照射引起的细胞DNA损伤表现为DNA光产物在嘧啶位点的形成,其中75%以上为环丁烷嘧啶二聚体（CPDs）,剩下部分为6-4光产物（（6-4）PPs）及其同源异构体。DNA光产物的清除主要通过核苷酸切除修复（NER）途径,当损伤细胞未能得到完全修复时,残余光产物能引发免疫抑制,最终致肿瘤形成。绿茶提取物茶多酚的主要活性成分表没食子儿茶素没食子酸酯（（-）-epigallocatechin-3-gallate,EGCG）有着广泛的生物学效应,如抗氧化、清除氧自由基、预防肿瘤的发生和抑制肿瘤细胞增殖等作用。有实验报道EGCG对UVB诱导细胞内光产物的清除有明显促进作用,从而可抑制肿瘤的发生。本实验组已经就EGCG和UVB干预对HaCaT细胞、人原代成纤维细胞光产物的影响进行了一系列研究,但尚无黑素细胞方面的研究和探讨。目的:观察黑素细胞合成培养基培养下人原代表皮黑素细胞的生长情况。观察UVB诱导人原代表皮黑素细胞光产物形成和清除情况及EGCG对此过程的干预作用,从而对黑素细胞光产物变化情况和EGCG光保护效应进行初探。材料与方法:1.人原代表皮黑素细胞的分离和培养:黑素细胞合成培养基培养人原代黑素细胞,观察其生长情况。定量接种于培养皿或96孔板中进行下步实验;2.紫外线照射和EGCG干预处理:根据实验设计定时定量照射培养细胞,并预先或在UVB照射后加入药物进行干预处理;3.细胞损伤的形态学观察:光学显微镜观察紫外线照射对细胞形态学的影响;4.药物浓度筛选:MTT法检测细胞增殖活性,以定量无细胞毒性的实验用药物浓度;5.光损伤产物形成及清除检测:采用免疫荧光法和免疫细胞化学法定性检测,免疫斑点印迹法定量分析胸腺嘧啶二聚体（CPDs）的形成和清除情况;6.流式细胞术检测UVB、EGCG处理对MC凋亡和细胞周期捕获的影响。结果:1.细胞培养情况:选用黑素细胞合成培养基培养人原代黑素细胞,最初可有较多角质形成细胞混杂,经两次选择差异胰酶消化法,第3代黑素细胞纯度几乎达100%。传代后细胞形态规则,一般具有2～5根树突,能维持8～10代的增殖活性。2.UVB照射对黑素细胞形态学的影响:黑素细胞经30mJ/cm2UVB照射后,0.5h时未有明显形态改变。24h时有细胞悬浮;大部分细胞树突变短,细胞膜边界模糊;个别细胞树突完全消失,细胞皱缩呈圆形。3.不同浓度EGCG对表皮黑素细胞增殖率的影响:10、20mg/L EGCG能促进黑素细胞增殖（P＜0.05）,但两者之间无统计学意义。当浓度高于40 mg/L时,细胞增殖则明显受抑制（P＜0.01）,相差显微镜下观察发现大部分细胞皱缩,树突变短减少,说明40mg/L以上药物浓度影响细胞生长。30mJ/cm2UVB照射MC增殖率显著下降（P＜0.05）,10、20mg/L EGCG能减轻此效应,细胞增殖率变化差值高于非照光组（P＜0.05）。选择10、20mg/L为下步实验用药物浓度。4光产物形成和清除的定性、定量检测:免疫荧光法、免疫细胞化学法均显示:照光组0.5h见几乎所有细胞内均有阳性产物形成,局限于细胞核内。未照光组未见阳性产物。免疫印迹技术定量分析未照光组无CPDs形成,UVB组、UVB+10 mg/L组、UVB+20mg/L组0.5h后CPDs形成率分别为100%、101.23%、103.31%,各组比较差异无统计学意义。24h后CPDs残余率分别为83.03%、75.09%、11.55%,各组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。5.流式细胞术显示UVB能诱导MC凋亡,从空白组的8.31%升为50.62%,细胞捕获于G1期,而20mg/L EGCG处理能使MC凋亡率降为39.26%,但G1期捕获现象更加明显。结论:黑素细胞合成培养基培养人原代黑素细胞生长良好,可替代传统的黑素细胞培养基进行实验研究。EGCG对UVB诱导CPDs的形成无明显干预作用,但能加速CPDs的清除。
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