2006年山东省猪“高热病”病理学观察及病原分离鉴定

论文摘要

猪繁殖与呼吸综合征（ Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起不同日龄、性别和品种的猪的一种高度接触性传染病。主要以引起母猪繁殖障碍及仔猪和生长猪出现呼吸系统疾病和较高的死亡率为特征,自1987年首次在美国暴发,目前已遍布全球主要养猪国家。近年来随着集约化养猪规模的不断扩大,PRRSV对养猪业构成了较大的威胁,对世界养猪业造成了灾难性的经济损失。本研究主要为弄清2006年山东省大部分地区暴发的一种以高热、高致病性和高死亡率为特征的猪“高热病”的病因。对山东各地送检的15例19头猪“高热病”典型病例进行临床病理剖检和病理组织学观察,用PCR或RT-PCR方法就猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪Ⅱ型圆环病毒（PCV-2）、伪狂犬病毒（PRV）及弓形虫进行分子生物学诊断,同时进行细菌分离培养。结果显示19头病猪均出现间质性肺炎、病毒性脑炎、全身性淋巴组织急性坏死以及不同程度的实质器官变性坏死。9头病猪表现卡他性或出血性卡他性胃肠炎。19头病猪PRRSV、PCV-2、CSFV的检出率分别为100%、21.2%、10.5%, 73.7%的病例能分离到大肠杆菌、葡萄球菌、链球菌以及支原体等,病猪器官免疫组化染色显示PRRSV在肺和扁桃体等组织中呈强阳性反应。这提示PRRSV才是2006年山东省猪“高热病”的主导致病原,同时又有多种病原参与。利用Marc-145细胞,从RT-PCR检测为阳性的“高热病”病猪除菌肺脏中分离出1株PRRSV,命名为SD-14。病料接种Marc-145细胞后,第二代开始出现明显的细胞病变。从其第4代分离毒株中提取RNA,用PRRSV的特异性引物可扩增目的片断。将Marc-145细胞传代于24孔细胞培养板,测得第四代分离毒的TCID50为10-6.5/0.1mL。间接免疫荧光技术检测结果表明,接毒后36h可于胞浆内检测到特异性荧光。收集80%出现病变后的接毒细胞制作超薄切片,投射电镜下可观察到大约70nm的典型病毒粒子。对PRRSV极易发生变异的完整的Nsp2及ORF5基因组核酸序列扩增,并进行测序。应用DNAStar软件分析所测序列,并与PRRSV国内外毒株JXA1,HEB1,HnNh1,GD, LN, SHH,CH-1a, S1、HB-1、HB-2、美洲型VR-2332株相应基因组序列进行对比。结果显示SD14株与同时期分离自不同地区高热病毒株的Nsp2、ORF5基因氨基酸同源性分别达到98.3%-98.9%和98.5%-99.5%,而与2006年以前分离毒株氨基酸同源性为77.2%-87.7%和87.1%-93%。而且Nsp2碱基存在两处连续碱基缺失,其中一处碱基为编码连续29个氨基酸的缺失。本研究证明新出现的以Nsp2基因部分缺失为特征的PRRSV变异株可能是2006年山东省猪“高热病”的主要病因。

论文目录

• 英文所略表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 文献综述
• 1 PRRSV 的结构与生物学特性
• 1.1 病毒的分类
• 1.2 病毒的形态结构
• 1.3 病毒的理化性质
• 1.4 PRRSV 的生物学结构
• 1.5 PRRSV 的变异
• 1.6 PRRSV 培养特性
• 2. PRRSV 的免疫学与致病机理
• 2.1 免疫学特点
• 2.2 PRRSV 致病机理
• 2.3 PRRSV 的持续感染与免疫抑制
• 3. PRRSV 的流行病学
• 3.1 发病特点
• 3.2 临床症状与病变
• 3.3 防治措施
• 4. PRRS 方法诊断
• 4.1 病毒分离与鉴定
• 4.2 抗原检测
• 4.3 分子生物学诊断
• 4.4 血清学诊断
• 4.5 诊断注意事项
• 5. PRRSV 与猪“高热病”
• 6. 本研究目的和意义
• 实验一 2006 年山东省猪“高热病”病原学诊断
• 摘要
• 1 材料
• 1.1 试剂和仪器
• 1.2 引物设计
• 2 方法
• 2.1 流行病学调查及临床症状观察
• 2.2 临床病例的病理学诊断与病料采集
• 2.3 淋巴结和脾脏中病毒 DNA 的提取
• 2.4 肺脏中病毒 RNA 的提取
• 2.5 PRRSV 与 CSFV 的 RT-PCR 检测
• 2.6 PCV-2、TOX 以及 PRV 的 PCR 检测
• 2.7 PRRSV 免疫组化检测
• 2.8 细菌培养
• 2.9 血清学诊断
• 3 结果
• 3.1 猪“高热病”发病情况调查
• 3.2 猪“高热病”病例临床症状
• 3.3 猪“高热病”自然病例的剖检病变
• 3.4 猪“高热病”自然病例的镜检病变
• 3.5 免疫组化染色结果
• 3.6 PCV-2、TOX 以及PRV 的PCR 检测
• 3.7 PRRSV 与 CSFV 的 RT-PCR 检测
• 3.8 细菌培养
• 3.9 相关病原检测结果
• 3.10 血清学检测
• 4 分析与讨论
• 实验二 猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离与鉴定
• 摘要
• 1 材料
• 1.1 病料
• 1.2 RT-PCR 相关试剂及溶液的配制
• 1.3 病毒分离用细胞、实验动物及培养基
• 1.4 鉴定用荧光抗体及试剂
• 1.5 主要仪器设备
• 2. 方法
• 2.1 引物的设计与合成
• 2.2 病毒 RNA 的提取
• 2.3 RT-PCR
• 2.4 细胞培养物中 DNA 的提取
• 2.5 细胞培养物中 PCV-2、TOX 以及 PRV 的 PCR 检测
• 2.6 病毒分离
• 2.7 病毒鉴定
• 2.7.1 RT-PCR 鉴定
• 2.7.2 间接免疫荧光（IFA）试验
• 2.7.3 电镜观察
• 2.7.4 TCID50 的测定
• 2.7.5 分离毒的血凝性试验
• 3. 试验结果
• 3.1 “高热病”病猪肺脏中 PRRSV 的分离与 RT-PCR 鉴定
• 3.2 间接免疫荧光抗体鉴定
• 50的测定'>3.3 TCID₅₀的测定
• 3.4 透射电镜观察
• 3.5 病毒血凝性实验
• 4. 讨论
• 4.1 关于 PRRSV 的细胞培养
• 4.2 关于 PRRSV 的间接免疫荧光试验和电镜观察
• 实验三 PRRSV SD-14 株 Nsp2 及 ORF5 基因核酸扩增及其序列分析
• 摘要
• 1. 材料与方法
• 1.1 毒株
• 1.2 PRRSV 毒株参考序列
• 1.3 实验耗材
• 1.4 实验仪器设备
• 1.5 扩增引物的设计
• 2. 方法
• 2.1 PRRSV 的增殖
• 2.2 PRRSV 感染的 Marc-145 细胞中总 RNA 的提取
• 2.3 RT-PCR 反应
• 2.4 凝胶回收 DNA
• 2.5 Nsp2 及 ORF5 基因序列测定及基因同源性分析
• 3 结果
• 3.1 Nsp2 及 ORF5 各片段的 RT-PCR 扩增结果
• 3.2 Nsp2 及 ORF5 片段的测序结果
• 3.3 Nsp2，ORF5 基因组同源性分析
• 4 分析与讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 附录3
• 攻读学位期间的论文
• 致谢