首页> 正文

牛疱疹病毒5型糖蛋白基因gG功能研究

2020-12-16阅读(641)

牛疱疹病毒5型糖蛋白基因gG功能研究

论文摘要

BHV-1、BHV-5属于疱疹病毒科、α疱疹病毒亚科、水痘病毒属。BHV-1目前在世界范围内流行,除南美部分国家之外,世界各国都已分离到该病毒。该病毒引起以鼻气管炎、高热、流产、眼结膜炎、传染性脓疱为特征的呼吸道疾病,还可引起外阴道炎、普遍的全身感染,每年给养牛业带来的损失超过10亿美元。BHV-5能够引起牛致命性脑膜脑炎。BHV-5能进入中枢神经系统（CNS）,能够引起小牛严重的致死性的脑膜脑炎,引起成年牛亚临床症状,给养牛业造成很大的损失。gG是BHV的主要囊膜糖蛋白之一,它在α疱疹病毒中相对保守,gG可影响病毒在宿主细胞内有效增殖与细胞间扩散,在体外与病毒在细胞间侵染有关,并且可以阻止细胞的凋亡,但BHV-1 gG和BHV-5 gG的趋化能力是否有差异还不明确,BHV-5 gG胞外区能够和趋化因子结合,但具体的功能域尚不清楚。本研究构建了几个突变株,通过动物试验探讨gG对BHV-5致病性的影响。利用杆状病毒表达系统分段表达了BHV-5 gG片段,进一步通过做趋化试验,探讨BHV-1 gG和BHV-5 gG的趋化能力的差异以及BHV-5 gG具有趋化功能的区域。主要工作包括：1.突变株的构建本试验以牛疱疹病毒5型全基因组（基因登录号为AY261359）为模板,设计引物,PCR扩增gG基因上游约1.0kb和下游1.1kb的片段作为同源重组臂,分别克隆到pMD18-T载体上。用相应的限制性内切酶将下游同源臂片段回收,定向插入到含有上游同源臂片段的载体中,构建中间转移载体,命名为pZF09-13。然后在上下游同源臂中间插入带有完整启动子的EGFP报告基因,构建重组转移质粒,命名为pZF09-14。将pZF09-14线性化,回收含有上下游同源臂的序列,并将其与质粒pBICPO和BHV-5基因组DNA用磷酸钙转染法在MDBK上共转染,成功地进行了同源重组,经过4轮筛选和纯化获得了BHV-5△gG/EGFP突变株。用同样的方法成功构建BHV-5△gG/EGFP回复突变株和BHV-1△gG/EGFP回复突变株。2.BHV-5 gG表达系统的建立将BHV-5 gG的蛋白序列用软件分析,分为三段,分别设计引物,以pZF09-40为模板扩增各片段,将各片段分别克隆到pMD18-T载体上,经测序鉴定后,原核表达系统表达,并用western验证。再用限制性内切酶酶切回收,克隆到pFastBacTM1载体,提取重组的bacmid,转染sf9细胞,用PCR验证重组杆状病毒gG基因的插入,再感染High-five细胞,经western验证,gG片段得到表达。gGl大小为27KD,gG2未表达,gG3大小为55KD。3.趋化试验将BHV-5 wt、BHV-5△gG/EGFP、BHV-5△gG/EGFP rev、BHV-1 wt、BHV-1△gG/EGFP、BHV-1△gG/EGFP rev按1个MOI接种MDBK细胞,24h后,收获上清,作为趋化反应样品,将样品与趋化因子同时加到趋化小室中,作用30min,在上面小室中加中性粒细胞,45min后,计算趋化小室中的细胞数,BHV-1和BHV-5组内的三株病毒的趋化性无明显差异。按上述方法检测BHV-5 gG蛋白不同区段与趋化因子结合的能力,结果表明gG2结合能力较强。4.动物试验试验以新西兰白兔为动物试验模型,分两组,一组用BHV-5wt接种,另一组用BHV-5△gG/EGFP接种。每天观察动物神经症状,结果7dpi时BHV-5wt组和BHV-5△gG/EGFP组都出现神经症状,表明在急性感染期gG缺失对BHV-5的毒力没有影响。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 缩略语表（Abbreviation）
  • 第1章 文献综述
  • 1.1 BHV-5的发现及分类地位
  • 1.2 BHV-5的分子生物学特征
  • 1.3 趋化因子
  • 第2章 研究目的和意义
  • 第3章 材料与方法
  • 3.1 试验材料
  • 3.1.1 病毒、菌种、质粒与细胞
  • 3.1.2 相关试剂（盒）及耗材
  • 3.1.3 主要试剂及溶液的配制
  • 3.1.4 本研究中所用的寡核苷酸引物及抗体
  • 3.1.5 试验动物
  • 3.2 试验方法
  • 3.2.1 病毒滴度（PFU）的测定
  • 3.2.2 病毒的增殖
  • 3.2.3 病毒基因组DNA的制备
  • 3.2.4 转移质粒的构建
  • 3.2.5 重组病毒的构建
  • 3.2.6 细胞蛋白的处理
  • 3.2.7 病毒粒子提取
  • 3.2.8 基因克隆与原核表达
  • 3.2.9 杆状病毒表达
  • 3.2.10 抗体制备及检测
  • 3.2.11 中性粒细胞的提取
  • 3.2.12 趋化试验
  • 3.2.13 动物试验
  • 第4章 结果与分析
  • 4.1 BHV-5 gG生物学性分析
  • 4.2 BHV-5 gG的克隆及表达
  • 4.2.1 BHV-5 gG各片段PCR扩增
  • 4.2.2 BHV-5 gG原核表达及验证
  • 4.2.3 BHV-5 gG各片段杆状病毒表达系统表达及验证
  • 4.3 重组病毒构建及鉴定
  • 4.3.1 BHV-5 △gG/EGFP突变株的构建
  • 4.3.2 BHV-5 △gG/EGFP rev突变株的构建
  • 4.3.3 BHV-1 AgG/EGFP rev的构建
  • 4.3.4 空斑大小比较
  • 4.4 趋化试验
  • 4.4.1 预试验
  • 4.4.2 病毒的趋化试验
  • 4.4.3 蛋白质的趋化试验
  • 4.5 动物试验
  • 第5章 讨论与结论
  • 5.1 糖蛋白gG对增殖能力的影响
  • 5.2 糖蛋白gG的趋化能力
  • 5.3 糖蛋白gG对致病性的影响
  • 5.4 结论
  • 参考文献
  • 致谢

    • 相关论文文献

    • [1].伪狂犬病毒重组gG抗原片段的原核表达及其间接酶联免疫吸附测定方法的建立[J]. 北京农学院学报 2021(01)
    • [2].蜗牛GG的秘闻录[J]. 红领巾(成长) 2019(Z1)
    • [3].鸭瘟病毒河南株gG基因的克隆、测序[J]. 华北农学报 2011(06)
    • [4].鼠李糖杆菌GG对小鼠急性酒精性肝损伤的保护作用研究[J]. 温州大学学报(自然科学版) 2020(04)
    • [5].自制GG纯钛瓷粉生物安全性的评价[J]. 牙体牙髓牙周病学杂志 2009(08)
    • [6].羧甲基壳聚糖对茜素黄GG的絮凝作用[J]. 环境科学与技术 2009(04)
    • [7].利用不同沉积微相的感应曲线侵入特性识别油水层——以二连盆地GG凹陷为例[J]. 石油地质与工程 2008(03)
    • [8].低速离心法测定荧光红GG脂质体包封率[J]. 浙江工业大学学报 2009(05)
    • [9].编辑GG的有趣对话[J]. 小雪花(初中高分作文) 2019(09)
    • [10].基于ITD模糊熵和GG聚类的滚动轴承故障诊断[J]. 仪器仪表学报 2014(11)
    • [11].奶牛传染性鼻气管炎病毒gG基因PCR检测方法的建立[J]. 中国畜牧兽医 2011(10)
    • [12].表达狂犬病病毒糖蛋白的重组伪狂犬病病毒gG-基因缺失转移载体的构建[J]. 吉林农业大学学报 2008(06)
    • [13].牛传染性鼻气管炎病毒内蒙古分离株gG基因的PCR扩增[J]. 畜牧与饲料科学 2011(06)
    • [14].焙烧态镁铝水滑石对茜素黄GG的吸附[J]. 龙岩学院学报 2011(05)
    • [15].酸性媒介黄GG插层水滑石的理论研究[J]. 计算机与应用化学 2010(04)
    • [16].鼠李糖乳杆菌GG发酵驼乳与牛乳的发酵特性和降糖活性比较[J]. 食品工业科技 2019(24)
    • [17].基于谱熵与弯曲时间特征的性能退化GG聚类[J]. 中国工程机械学报 2020(02)
    • [18].基于多元经验模态分解互近似熵及GG聚类的轴承故障诊断[J]. 中国机械工程 2016(24)
    • [19].鸡传染性喉气管炎病毒gG蛋白多克隆抗体的制备及初步应用[J]. 中国兽医科学 2014(02)
    • [20].For Fun战术系列——GG地精流[J]. 电子竞技 2011(01)
    • [21].8%噻呋酰胺·嘧菌酯GG防治水稻纹枯病的田间药效试验研究[J]. 南通职业大学学报 2019(04)
    • [22].口服鼠李糖乳杆菌GG影响哺乳仔猪肠道屏障功能的研究（英文）[J]. Journal of Zhejiang University-Science B(Biomedicine & Biotechnology) 2019(02)
    • [23].伪狂犬病病毒Kaplan株糖蛋白gG基因的克隆与表达[J]. 现代畜牧兽医 2014(07)
    • [24].甘油葡萄糖苷αGG的制备方法及其研究进展[J]. 工业微生物 2020(04)
    • [25].自适应广义形态滤波和GG聚类在轴承故障识别中的应用研究[J]. 陕西理工大学学报(自然科学版) 2019(01)
    • [26].基于多维退化特征与GG模糊聚类的滚动轴承退化状态识别[J]. 东华大学学报(自然科学版) 2019(04)
    • [27].神经节苷脂(Gg)注射液对重症颅脑损伤患者血清神经元特异性烯醇化酶(NSE)的影响[J]. 临床研究 2019(11)
    • [28].基于GG模糊聚类的退化状态识别方法[J]. 仪器仪表学报 2018(03)
    • [29].饲粮添加鼠李糖乳酸杆菌GG缓解轮状病毒感染对断奶仔猪血清尿素氮含量和免疫功能的影响[J]. 动物营养学报 2015(10)
    • [30].饲粮添加鼠李糖乳酸杆菌GG对轮状病毒感染的断奶仔猪回肠黏膜屏障功能的影响[J]. 四川农业大学学报 2019(01)

    标签：;  ;  ;  ;  

    牛疱疹病毒5型糖蛋白基因gG功能研究
    下载Doc文档

    猜你喜欢

    © 2024 毕速过 版权所有 鄂ICP备12018319号-5