棉花原生质体“供—受体”融合及遗传转化研究

论文摘要

棉花种质资源的创新是棉花遗传育种的基础。然而,利用现有的种质资源很难进行栽培棉种的遗传改良,主要是因为许多重要的性状（抗病虫害,抗除草剂等）在棉花栽培种基因库中十分贫乏。而在棉属的野生种和近缘种广泛存在这样的有益基因,通过传统的远缘杂交将野生种的抗性基因转移到陆地棉的方法也得到了一些组合,但是由于野生种和栽培种亲缘关系较远,杂交往往很难成功,或者育性很低。因而,利用野生种和近缘种来改良栽培种和创造新的种质资源是很有必要的。利用生物技术进行棉花的种质资源创新是一条有效途径,体细胞组织培养、原生质体融合和遗传转化在棉花育种中可以发挥重要的作用,在棉花的遗传改良上具有广阔的应用前景。本研究内容主要涉及鄂抗（Ekang）系列棉种体细胞胚胎发生、G染色体组野生棉G.bickii器官发生、陆地棉和野生棉原生质体“供-受体”融合和以原生质体为受体的遗传转化。所取得的主要结果如下:1.Ekang系列棉种体细胞胚胎发生。比较了不同激素组合对鄂抗棉品种愈伤组织早期诱导、胚性愈伤组织和体胚发生的影响。结果表明,2,4-D有利于愈伤组织早期的诱导和增殖;然而,凡添加有2,4-D的培养基均未能获得胚性愈伤组织,EKang5和EKang 8在添加NAA的培养基上形成黄色和灰白色交织的颗粒状的胚性愈伤,并获得再生植株;0.5 mg/L NAA+0.1 mg/L KT和0.5 mg/L IBA+0.1 mg/L KT相对有利于棉花胚性愈伤组织的保持和体细胞胚的萌发。2.G染色体组野生棉G.bickii器官发生。对影响G染色体组野生棉G.bickii器官发生的主要因素进行了研究,包括外植体的类型和取材时间、细胞分裂素的类型和浓度。在所使用的外植体中（子叶节、下胚轴、子叶）,只有子叶节能在添加BAP、TDZ或两者激素组合的培养基上诱导多芽（＞2）;高浓度的BAP（4 mg/L）和低浓度的TDZ（0.1 mg/L）比较适合G.bickii的多芽形成。另外,流式细胞仪和染色体数目分析表明G.bickii所有器官发生再生的植株无变异发生;RAPD分析表明这些植株有遗传同质性。3.陆地棉和野生棉原生质体“供-受体”融合。（1）融合前,用碘乙酰胺（IOA）处理受体原生质体,紫外线（UV）处理供体原生质体。比较了IOA不同处理液,处理温度、处理时间和处理浓度对陆地棉原生质体的影响,并选取CPW9M溶液稀释IOA至终浓度为0.5 mM,室温下处理15 min为IOA处理的最佳处理条件（处理后的原生质体培养不能持续分裂,但能存活数日,甚至有少数几次分裂,同时破碎率低）;比较了5个UV辐射剂量对野生棉原生质体的影响,选取38.7 J/cm2为UV辐射的最低辐射剂量（处理后的原生质体培养不能持续分裂,但能存活数日,甚至有少数几次分裂,同时破碎率低）。将此处理条件用于后面的原生质体融合实验中。（2）比较了不同电融合参数（交流电场强度及其作用时间,直流脉冲电场强度和脉冲时间,脉冲次数）对原生质体融合的影响,选取交流电场强度为100 V/cm、作用时间为15 s,直流脉冲场强1250 V/cm、脉冲时间30μs,脉冲次数3次为电融合参数（原生质体成串短、破碎率低、融合率高）。（3）开展了4个组合的原生质体“供-受体”融合,YZ-1+G.davidsonii得到融合再生植株。大部分再生植株表现与双亲不同的形态,也有形态介于双亲之间的,还有呈现簇生状态的,少量偏向于受体亲本的;染色体数目在40到73之间变化;RAPD和SSR分子检测证实了杂种植株的真实性,cpSSR和CAPS分子检测分析表明杂种植株线粒体和叶绿体的某些区域发生了重组。这是继棉花对称融合和基于紫外线处理的非对称融合之后的又一新的进展。4.开展以原生质体为受体的遗传转化。本实验以陆地棉YZ-1和野生种G.davidsonii为材料,分离胚性愈伤悬浮系原生质体作转化受体,选用绿色荧光蛋白（GFP）基因作为报告基因,采用电击穿孔转化法,将外源质粒（pBIN m-gfp5-ER）DNA转化到棉花原生质体中,以此研究棉花原生质体遗传转化技术体系。实验中,对影响转化效率的因素进行比较实验,结果表明电场强度为1000 V/cm、脉冲时间为20μs、质粒浓度为100 ng/μl时能够获得相对较高的转化效率,为5.36%左右。在上述转化条件下,YZ-1未获得转化愈伤组织;G.davidsonii获得再生愈伤组织440个,其中5个愈伤组织块有GFP荧光表达,并获得3株转化植株。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 棉花组织培养及生物技术研究进展
• 1.1 棉花体细胞组织培养
• 1.1.1 棉花体细胞胚胎发生
• 1.1.2 棉花器官发生
• 1.1.3 影响棉花体胚发生和器官发生的因素
• 1.1.3.1 基因型
• 1.1.3.2 外植体类型及生理状态
• 1.1.3.3 植物生长调节剂
• 1.1.3.4 培养条件
• 1.1.4 体细胞组织培养与棉花遗传改良
• 1.1.4.1 遗传转化受体
• 1.1.4.2 体细胞突变体的筛选和鉴定
• 1.1.4.3 原生质体融合
• 1.2 棉花原生质体培养和融合研究
• 1.2.1 棉花原生质体培养研究进展
• 1.2.2 棉花原生质体培养操作
• 1.2.3 影响棉花原生质体培养及植株再生的因素
• 1.2.3.1 外植体的选择
• 1.2.3.2 培养条件
• 1.2.4 棉花原生质体培养存在的问题和解决方法
• 1.2.5 棉花原生质体融合
• 1.2.5.1 对称融合
• 1.2.5.2 非对称融合
• 1.2.5.2.1 供体的处理
• 1.2.5.2.2 受体的处理
• 1.2.6 体细胞杂种鉴定
• 1.2.6.1 形态学鉴定
• 1.2.6.2 细胞学鉴定
• 1.2.6.3 分子生物学鉴定
• 1.2.7 棉花原生质体培养和融合的应用
• 1.2.7.1 遗传转化研究的材料
• 1.2.7.2 无性系变异筛选和突变育种
• 1.2.7.3 克服生殖障碍，创造新种质
• 1.2.7.4 转移抗逆性状，改良棉花品质
• 1.2.7.5 转移细胞质基因控制性状
• 1.2.7.6 创造中间材料
• 1.3 植物原生质体遗传转化研究
• 1.3.1 电击穿孔转化法
• 1.3.1.1 研究概况
• 1.3.1.2 转化原理
• 1.3.1.3 影响转化效率的因素
• 1.3.2 PEG介导转化法
• 1.3.2.1 研究概况
• 1.3.2.2 转化原理
• 1.3.2.3 影响转化效率的因素
• 1.3.3 农杆菌与原生质体共培养转化法
• 1.3.3.1 研究概况
• 1.3.3.2 基本步骤
• 1.3.3.3 影响转化效率的因素
• 1.3.4 脂质体介导转化法
• 1.3.4.1 研究概况
• 1.3.4.2 转化原理
• 1.3.4.3 影响转化效率的因素
• 1.3.5 其他转化方法
• 1.4 GFP报告基因的应用
• 1.4.1 发光机制
• 1.4.2 GFP的应用领域
• 1.4.2.1 作为报告基因用于转化研究
• 1.4.2.2 作为荧光标记
• 1.4.2.3 作为报告蛋白用于基因表达研究
• 1.5 本课题的研究目的和意义
• 1.5.1 棉种体细胞胚胎发生和器官发生研究
• 1.5.2 棉花原生质体“供-受体”融合研究
• 1.5.3 建立以原生质体为受体的遗传转化体系
• 第二章 不同基因型棉种体细胞胚胎发生和器官发生
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 方法
• 2.1.2.1 鄂抗棉体细胞胚胎发生
• 2.1.2.1.1 培养基和培养条件
• 2.1.2.1.2 无菌苗制备和愈伤组织的诱导
• 2.1.2.1.3 愈伤组织的增殖及体胚的诱导
• 2.1.2.1.4 体胚成熟、萌发与植株移栽
• 2.1.2.2 比克棉器官发生
• 2.1.2.2.1 培养基和培养条件
• 2.1.2.2.2 多芽的诱导
• 2.1.2.2.3 芽的伸长和根的诱导
• 2.1.2.2.4 组织学鉴定
• 2.1.2.2.5 倍性测定和染色体数目分析
• 2.1.2.2.6 RAPD检测再生植株及其子代与亲本植株的同质性
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 鄂抗棉体细胞胚胎发生和植株再生
• 2.2.1.1 不同激素组合对鄂抗棉品种愈伤组织早期诱导的影响
• 2.2.1.2 不同激素组合对鄂抗棉胚性愈伤组织和体胚发生的影响
• 2.2.2 比克棉器官发生和植株再生
• 2.2.2.1 比克棉器官发生
• 2.2.2.2 再生植株的倍性测定和染色体数目分析
• 2.2.2.3 RAPD分析检测再生植株与亲本的同质性
• 2.3 讨论
• 第三章 原生质体“供-受体”融合亲本的预处理
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 方法
• 3.1.2.1 悬浮系的建立
• 3.1.2.2 原生质体分离与纯化
• 3.1.2.3 原生质体预处理和培养
• 3.1.2.4 原生质体活力，分裂频率和植板率检测
• 3.1.2.5 流式细胞仪分析
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 IOA处理对原生质体的影响
• 3.2.2 UV处理对原生质体的影响
• 3.3 讨论
• 第四章 棉花原生质体“供-受体”融合
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 方法
• 4.1.2.1 原生质体分离、纯化和预处理
• 4.1.2.2 电融合参数的选择
• 4.1.2.3 原生质体电融合、培养及再生
• 4.1.2.4 再生植株细胞学观察
• 4.1.2.5 再生植株分子检测
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 电融合参数对原生质体融合的影响
• 4.2.1.1 交流电场强度及其作用时间对原生质体融合的影响
• 4.2.1.2 直流脉冲电场强度和脉冲时间对原生质体融合的影响
• 4.2.1.3 脉冲次数对原生质体融合率的影响
• 4.2.2 开展的“供-受体”融合
• 4.2.3 YZ-1和G. davidsonii原生质体“供-受体”融合
• 4.2.3.1 原生质体融合，植株再生和形态观察
• 4.2.3.2 再生植株染色体数目分析
• 4.2.3.3 再生植株分子检测
• 4.3 讨论
• 第五章 以原生质体为受体的遗传转化
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.1.1 植物材料、菌株及质粒载体
• 5.1.1.2 质粒 DNA抽提液配方
• 5.1.2 方法
• 5.1.2.1 原生质体的制备
• 5.1.2.2 GFP质粒DNA的抽提与纯化
• 5.1.2.2.1 碱裂解法大量制备质粒DNA
• 5.1.2.2.2 质粒DNA检测
• 5.1.2.3 原生质体电击穿孔转化
• 5.1.2.4 转化后原生质体的培养，植株再生
• 5.1.2.5 GFP荧光检测
• 5.1.2.6 实验结果统计
• 5.1.2.7 转化再生植株的PCR检测
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 影响转化效率的因素
• 5.2.1.1 电击参数对转化效率的影响
• 5.2.1.2 质粒DNA浓度对转化效率的影响
• 5.2.2 原生质体中GFP基因的表达
• 5.2.3 转化植株再生
• 5.2.4 转化植株的PCR鉴定
• 5.3 讨论
• 参考文献
• 研究生阶段发表的文章
• 致谢