论文摘要
神经退行性疾病是影响人类健康的一类疾病的总称,包括阿尔茨海默病,帕金森病等。小胶质细胞是脑内具有巨噬细胞类似功能的一类细胞,在中枢神经系统的炎症进程中发挥重要作用。小胶质细胞的适度激活对神经元具有保护作用,然而过度激活的小胶质细胞释放大量的神经毒性因子,如一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）和白介素-6（IL-6）,导致阿尔茨海默氏病（Alzheimer′s disease,AD）、帕金森病（Parkinson′s disease,PD）、多发性硬化症（Multiple sclerosis,MS）、HIV痴呆（HIV-associated dementia,HAD）等神经退行性疾病的发生。抑制小胶质细胞的活化已经成为防治神经退行性疾病的一个重要策略。实验室前期研究表明,白藜芦醇（resveratrol,Res）可通过抑制小胶质细胞活化对神经元起到保护作用。本论文以NO释放为指标,拟从白藜芦醇系列衍生物中筛选对脂多糖（LPS）诱导的原代大鼠小胶质细胞激活具有较强抑制作用的化合物,并对其作用机制进行探讨。首先,采用MTT法考察了白藜芦醇及其60种衍生物与LPS联合应用对小胶质细胞存活率的作用,以排除药物毒性作用造成的影响。结果表明,白藜芦醇及其37种化合物（0.3-30μM）对LPS活化的小胶质细胞存活率无显著影响。此外,白藜芦醇及其37种化合物单独作用也不影响小胶质细胞的存活率。其次,采用Griess法,对37种白藜芦醇衍生物抑制LPS活化的原代大鼠小胶质细胞NO释放作用进行了活性筛选,并与白藜芦醇的活性作用进行比较。经过构效关系分析,得出结论:（1）白藜芦醇结构中间苯二酚的两个酚羟基甲基化,可以增强化合物抑制小胶质细胞NO释放的作用;（2）间苯二酚的两个酚羟基甲基化的同时,保留另一苯环上的羟基（RV32,紫檀芪）,可使化合物表现出较强的抑制小胶质细胞活化的作用;（3）以喹啉基替代另一个苯环（如RV01和RV02）,也可以使化合物的这一活性显著增强。根据构效分析的结果,选定白藜芦醇（Res）及其3种活性明显高于Res的衍生物（RV01、RV02和RV32）进行下一步的实验研究。其中RV01和RV02是新的化合物。采用倒置显微镜观察了Res、RV01、RV02和RV32对活化的小胶质细胞形态学改变的影响。结果发现,4种化合物（30μM）均可以在一定程度上抑制LPS活化的小胶质细胞形态改变。应用ELISA法检测了小胶质细胞释放TNF-α水平的变化。结果表明,Res、RV01、RV02和RV32对LPS激活小胶质细胞TNF-α的释放水平增高均具有显著的抑制作用,且RV01、RV02和RV32的作用强于Res。RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）的结果表明,4种化合物中Res、RV01和RV02可显著抑制活化的小胶质细胞IL-1β和IL-6 mRNA表达,而RV32对IL-1β和IL-6 mRNA表达有抑制趋势,但无显著影响。为考察4种化合物的对活性氮成分的捕捉能力,检测了它们对硝普钠溶液释放NO的影响。结果表明Res能够显著降低硝普钠溶液中NO2-的含量,显示出NO清除能力,而RV01、RV02和RV32均不能显著降低溶液中NO的水平。RT-PCR和Western-blotting（免疫印迹）的研究结果证明,这4种化合物均可以显著抑制LPS活化的小胶质细胞内NO相关蛋白——诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的蛋白和mRNA表达。对介导活化的小胶质细胞释放神经毒性物质的核转录因子（NF-κB）相关蛋白IκBα的磷酸化和降解,以及丝裂原蛋白激酶通路（MAPKs）中的相关蛋白p38 MAPK的磷酸化表达作了进一步的研究。结果表明,4种化合物能够抑制LPS激活的小胶质细胞内IκBα蛋白的磷酸化和降解。同时对p38 MAPK的磷酸化表达,也具有明显的的降低作用。接下来的研究结果证明了,4种化合物的这种作用与其抑制活化的小胶质细胞内ROS产生有关。最后,应用单细胞凝胶电泳技术（彗星实验）考察了这4种化合物对LPS激活小胶质细胞条件培养液造成原代大鼠皮质神经元DNA损伤的保护作用。LPS激活的小胶质细胞条件培养液作用于大鼠皮质神经元24 h可引起大鼠皮质神经元DNA的显著损伤。4种化合物本身对大鼠皮质神经元DNA没有显著影响,但均能够显著抑制活化的小胶质细胞条件培养液引起的神经元DNA损伤。提示4种化合物能够保护由于小胶质细胞活化引起的神经元损伤。综上所述,白藜芦醇及其3种衍生物（RV01、RV02和RV32）可抑制LPS活化的小胶质细胞释放神经毒性物质,并对活化的小胶质细胞造成的神经元损伤具有保护作用。4种化合物具有抗小胶质细胞炎症反应的作用,可能对小胶质细胞激活相关的神经退行性疾病具有潜在的防治作用。
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中文摘要英文摘要绪论一、小胶质细胞（microglia,Mic）二、小胶质细胞在神经退行性疾病中的作用三、小胶质细胞活化是一系列神经退行性改变的共同机制四、针对小胶质细胞介导神经退行性疾病的治疗五、白藜芦醇及其衍生物第一章 白藜芦醇及其衍生物抑制小胶质细胞活化的活性筛选及构效关系分析前言第一节 实验材料与方法1 实验材料2 实验方法2.1 化合物的来源和配制2.2 原代小胶质细胞分离、纯化和培养2.3 原代小胶质细胞的鉴定2.4 细胞存活率的测定2.5 亚硝酸盐含量的测定2.6 统计学方法第二节 实验结果1 大鼠原代培养小胶质细胞的分离2 原代小胶质细胞纯度的鉴定3 LPS激活原代大鼠小胶质细胞NO升高模型的建立4 白藜芦醇及其60种衍生物对小胶质细胞存活率的影响5 白藜芦醇及其37种衍生物对小胶质细胞基础NO释放的影响6 白藜芦醇及其37种衍生物对LPS激活的小胶质细胞NO释放的影响第三节 讨论小结第二章 白藜芦醇及其三种衍生物抑制小胶质细胞活化的药效学研究前言第一节 实验材料与方法1 实验材料2 实验方法2.1 白藜芦醇衍生物及其配制方法2.2 倒置显微镜观察小胶质细胞形态学改变2.3 亚硝酸盐含量的测定2.4 ELISA法检测小胶质细胞TNF-α释放的变化2.5 RT-PCR法考察小胶质细胞IL-1β和IL-6 mRNA表达的变化第二节 实验结果1 Res、RV01、RV02和RV32对激活的小胶质细胞形态学改变的影响2 Res、RV01、RV02和RV32对LPS活化的小胶质细胞NO释放的影响3 Res、RV01、RV02和RV32对LPS活化的小胶质细胞TNF-α释放的影响4 RNA的完整性鉴定5 Res、RV01、RV02和RV32对LPS活化的小胶质细胞IL-1β mRNA表达的影响6 Res、RV01、RV02和RV32对LPS活化的小胶质细胞IL-6 mRNA表达的响第三节 讨论小结第三章 白藜芦醇及其三种衍生物抑制小胶质细胞活化的机制研究前言第一节 实验材料与方法1 实验材料2 实验方法2.1 白藜芦醇衍生物及其配制方法2.2 NO清除作用的测定2.3 Western blot analysis（免疫印迹法）2.4 小胶质细胞iNOS蛋白表达的检测2.5 小胶质细胞iNOS mRNA表达的检测2.6 小胶质细胞核转录因子抑制因子iκBα蛋白磷酸化和降解的检测2.7 小胶质细胞p38 MAPK磷酸化的测定2.8 DPPH·自由基的清除作用的测定2.9 小胶质细胞内活性氧（ROS）水平的变化第二节 实验结果1 Res、RV01、RV02和RV32的NO清除作用2 Res、RV01、RV02和RV32对LPS活化的小胶质细胞内iNOS蛋白表达的影响3 Res、RV01、RV02和RV32对LPS活化的小胶质细胞内iNOS mRNA表达的影响4 Res、RV01、RV02和RV32对LPS活化的小胶质细胞内IκBα磷酸化和降解的影响5 Res、RV01、RV02和RV32对LPS活化的小胶质细胞内p38 MAPK磷酸化表达的影响6 Res、RV01、RV02和RV32对DPPH·自由基的清除作用7 Res、RV01、RV02和RV32对LPS活化的小胶质细胞内活性氧产生的影响第三节 讨论小结第四章 白藜芦醇及其三种衍生物对神经元的保护作用前言第一节 实验材料与方法1 实验材料2 实验方法2.1 白藜芦醇衍生物及其配制方法2.2 原代大鼠皮层神经元的分离纯化培养及鉴定2.3 条件培养液的制备2.4 Res、RV01、RV02和RV32对小胶质细胞活化导致神经元DNA损伤的抑制作用2.4.1 单细胞凝胶电泳（即彗星实验）检测神经元DNA的损伤2.4.2 条件培养液导致神经元DNA损伤的模型的确立2.4.3 Res、RV01、RV02和RV32条件培养液对原代培养大鼠皮层神经元DNA损伤的影响2.4.4 Res、RV01、RV02和RV32对正常原代培养大鼠皮层神经元DNA的影响第二节 实验结果1 原代大鼠皮层神经元的鉴定2 条件培养液造成神经元DNA损伤模型的确立3 Res对大鼠皮层神经元DNA损伤及LPS活化的小胶质细胞条件培养液引发的神经元DNA损伤的影响4 RV01对大鼠皮层神经元DNA损伤及LPS活化的小胶质细胞条件培养液引发的神经元DNA损伤的影响5 RV02对大鼠皮层神经元DNA损伤及LPS活化的小胶质细胞条件培养液引发的神经元DNA损伤的影响6 RV32对大鼠皮层神经元DNA损伤及LPS活化的小胶质细胞条件培养液引发的神经元DNA损伤的影响第三节 讨论小结结论参考文献致谢缩略词表发表文章个人简历
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