广谱caspase抑制剂抗小鼠接触性皮炎的研究

论文摘要

【目的】以Balb/c小鼠变应性接触性皮炎（ACD）模型及刺激性接触性皮炎（ICD）模型,研究外用广谱caspase抑制剂Z-VAD-FMK对皮肤炎症反应的抑制作用,观察其对T细胞的作用,阐明抗炎机制,为研制新型抗皮肤炎症外用药物提供关键数据。【方法】1.运用Franz垂直扩散池进行Z-VAD-FMK的体外透皮研究,高效液相色谱法（HPLC）检测药物含量;同时对其进行体内透皮研究,局部外用Z-VAD-FMK后将皮肤离体,以乙二醇去除表皮,剩余组织经液氮研磨组织匀浆,以液相色谱—串连质谱法（LC-MS/MS）检测药物浓度。2.以1-氟-2,4-二硝基苯（DNFB）制作经典ACD小鼠模型,取激发后不同时间点对经典ACD小鼠模型的评价指标进行探讨。3.以DNFB制作初次ACD小鼠模型,数显游标卡尺测量耳肿度随时间的动态变化,ELISA方法检测耳组织内Th1细胞因子IL-2、INF-γ及Th2细胞因子IL-4的表达水平,Real time RT-PCR方法检测细胞因子mRNA水平,流式细胞术检测耳引流淋巴结中T淋巴细胞的增殖活性及表面活化标记,从上述方面对初次ACD小鼠模型与经典ACD小鼠模型进行评价比较。4.以经典ACD小鼠模型及初次ACD模型,观察外用Z-VAD-FMK对ACD的治疗作用、对ACD激发的抑制作用及对ACD诱导的抑制作用。5.以ELISA方法检测Z-VAD-FMK干预ACD治疗、ACD激发及ACD诱导实验中耳组织内Th1细胞因子IL-2与INF-γ的表达水平,以real-time RT-PCR方法检测耳组织内IL-2 mRNA与INF-γmRNA的水平。6.进行小鼠局部淋巴结分析（LLNA）,以BrdU—流式细胞术检测外用Z-VAD-FMK对耳引流淋巴结中T淋巴细胞增殖活性的影响,以流式细胞术检测其对T淋巴细胞活化的影响;7.以巴豆油制作小鼠ICD模型,观察外用Z-VAD-FMK对ICD的抑制作用。【结果】1.体外透皮研究中,在Franz垂直扩散池供给池为20mM Z-VAD-FMK 200μl、接收池为4ml 0.9%NaCl、有效扩散面积为1cm2的条件下,Z-VAD-FMK 6h、12h及24h的透皮率分别为5.35%、15.52%及22.76%;体内透皮研究中,间隔12h的2次外用2.5mM Z-VAD-FMK 15μl后,其在耳组织中的浓度可达100μM,这与体外实验中的有效浓度相近。2.经典ACD中,与激发后耳肿度一样,激发后双侧耳重量之差与激发后组织切片显微镜下同一位置左右侧耳双面距离之差这2种客观性更强的指标亦显示出一致的随时间变化趋势,即:激发后（1-2）d,炎症程度达到高峰,随后逐渐减弱,4d后已减至一半左右。3.初次ACD小鼠模型耳背部用药6d后出现较明显的耳肿度变化,这与经典ACD模型自诱导至炎症出现的时间相同;与经典ACD小鼠模型相似,初次ACD模型的耳肿度亦呈现出随时间变化的趋势:用药后（7-8）d,耳肿度达到高峰,随后逐渐减弱,9d后已减至一半左右;二者耳组织中的浸润细胞均以单一核细胞为主;与正常对照相比,二者耳组织中Th1型细胞因子IL-2与INF-γ的表达均增加,其差别均有统计学意义,而Th2型细胞因子IL-4均未增加,差别无统计学意义;与正常对照相比,二者耳引流淋巴结中T淋巴细胞掺入的BrdU的荧光强度均增高,T淋巴细胞3种表面活化标记（CD69、CD25及Ia）阳性细胞的百分率亦均升高,其差别均有统计学意义。4.将Z-VAD-FMK外用于ACD小鼠模型,与阴性对照相比,激发后2h用药、激发前用药及诱导前用药这3种情况下ACD观察指标均下降,其差别均有统计学意义。5.上述3种情况下,与阴性对照相比,Z-VAD-FMK处理组耳组织中IL-2与INF-γ的表达均减少,差别均有统计学意义。6.LLNA中,与阴性对照相比,Z-VAD-FMK处理组耳引流淋巴结中T淋巴细胞掺入的BrdU的荧光强度均减弱,T细胞3种表面活化标记（CD69、CD25及Ia）阳性细胞的百分率亦均下降,其差别均有统计学意义。7.在干预ICD的实验中,无论是治疗研究还是预防研究,与阴性对照相比,Z-VAD-FMK处理组3个观察指标的差别均无统计学意义。【结论】1.广谱caspase抑制剂Z-VAD-FMK对皮肤有一定的通透性,为其作为皮肤外用药物提供了可能。2.经典ACD小鼠模型与初次ACD小鼠模型均为Th1型免疫反应,二者在临床、组织病理学、组织中细胞因子表达及局部引流淋巴结中的表现均相似,可以互用,从而丰富了ACD小鼠模型,为研究抗炎、抗免疫新药提供了新的模型选择。3.外用广谱caspase抑制剂Z-VAD-FMK可以有效抑制ACD的发生,其对ACD的诱导及激发亦均有抑制作用。4.外用广谱caspase抑制剂Z-VAD-FMK对巴豆油引起的ICD无明显抑制作用,提示其抗刺激性炎症的作用较弱。5.外用广谱caspase抑制剂Z-VAD-FMK可以抑制皮肤及局部引流淋巴结中T淋巴细胞的增殖与活化,从而有效抑制ACD的发生。6.为了能更好地利用广谱caspase抑制剂Z-VAD-FMK局部外用的抗炎作用,需进行试剂的进一步研制,使其尽可能摆脱DMSO的影响,并对其剂型进行优化,增强透皮作用,从而将其抗皮肤炎症作用发挥到最大。

论文目录

• 中英文索引
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 广谱caspase抑制剂Z-VAD-FMK的透皮研究
• 第一节 Z-VAD-FMK的体外透皮研究
• 材料与方法
• 结果
• 第二节 Z-VAD-FMK的体内透皮研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 变应性接触性皮炎小鼠模型的建立与评价
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 Z-VAD-FMK对小鼠变应性接触性皮炎的作用研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第四部分 Z-VAD-FMK抑制小鼠变应性接触性皮炎的作用机制研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第五部分 Z-VAD-FMK对小鼠刺激性接触性皮炎的作用研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 博士在读期间发表文章
• 附录 综述Caspase在T细胞活化与增殖中的作用
• 致谢