半闭弯尾姬蜂调控寄主小菜蛾的生理机制研究

论文摘要

本文对十字花科蔬菜重要害虫一小菜蛾Plutella xylostella幼虫的优势种寄生蜂半闭弯尾姬蜂Diadegma semiclausum对寄主的生理调控机制进行了研究，取得以下结果：一、半闭弯尾姬蜂寄生对寄主免疫系统的影响寄主小菜蛾幼虫被寄生后，其造血器官内原血细胞结构受到一定程度的破坏，是造成血细胞数量显著下降的原因之一；但是血腔内成熟血细胞并不出现坏死或加速凋亡的现象。被寄生的寄主幼虫的血细胞总量在寄生后12 h呈现出相对于对照的显著低水平，且这种水平一直维持至寄主幼虫死亡。此外，寄生后1 h的寄主幼虫血细胞体外培养30 min后，不能延展，所有的细胞均呈现圆饼状，不具有包囊能力，黑化作用受到抑制，但噬菌能力并未受到影响；而寄生后24 h的寄主幼虫血细胞虽然已经能够进行正常的延展，恢复部分包囊能力，黑化作用的抑制程度减轻，但是其噬菌能力却显著降低。被半闭弯尾姬蜂寄生后的寄主体液免疫能力降低，如酚氧化酶酶原的激活受抑制、血淋巴抗菌效能降低等。二、半闭弯尾姬蜂寄生对寄主解毒酶系统和保护酶的影响半闭弯尾姬蜂寄生对寄主幼虫的解毒酶系统产生一定程度的影响，主要结果为：1)寄生能够显著提高寄主幼虫体内谷胱甘肽-s-转移酶的活性；2)多功能氧化酶和羧酸酯酶的酶活力不受影响；3)半闭弯尾姬蜂寄生显著降低乙酰胆碱酯酶的活性。另外，寄生后小菜蛾幼虫的保护酶活性也发生一定的变化：1)过氧化物歧化酶（Superoxidedismutase，SOD）的活性在寄生后12 h显著降低至对照的50%左右，但是在此后12 h该酶活性恢复至正常水平；2)过氧化氢酶（Catalase，CAT）的活力不受半闭弯尾姬蜂寄生的影响；3)过氧化物酶（Peroxisome，POD）活力变化显著，寄生后1 h即与对照呈显著差异。三、半闭弯尾姬蜂寄生对寄主营养代谢的影响在小菜蛾-半闭弯尾姬蜂系统中，寄主幼虫血淋巴内海藻糖浓度升高的同时脂肪体内糖原积累受到抑制；在小菜蛾-菜蛾盘绒茧蜂系统中，寄主幼虫血淋巴内海藻糖浓度也显著升高，而且这种现象的产生与寄主幼虫体内脂肪体糖原的加速降解和脂滴转移有关。在两个系统中，虽然寄生后幼虫的糖原磷酸化酶及海藻糖酶的活力发生一定程度的变化，但是这两种酶的变化并不直接导致海藻糖浓度的升高。寄生后小菜蛾幼虫的血淋巴内蛋白总量发生显著变化，同时中肠内各类消化酶之间的协调性被打破。总胰蛋白酶、弱碱性类胰蛋白酶、强碱性类胰蛋白酶活力均发生不同程度的改变，且这些酶类对酸碱环境的适应性也发生了一定程度上的变化。在脂类代谢方面，半闭弯尾姬蜂寄生对小菜蛾脂肪体重量的影响主要发生在幼虫后期及预蛹期。在4龄后期，对照幼虫脂肪体开始不断积累营养物质，脂肪体重量逐渐增大；而寄生后幼虫体内的脂肪体总量却呈现下降的趋势。半闭弯尾姬蜂对寄主脂肪体的利用分寄主幼虫期和寄主预蛹期两个阶段进行：寄主幼虫期阶段，幼蜂的总脂滴含量与小菜蛾幼虫的血淋巴总脂滴含量显著相关（P=0．2976H+4．9877，r2=0．9824；P代表幼蜂总脂滴含量，H代表小菜蛾幼虫血淋巴的总脂滴含量）；寄主预蛹阶段，幼蜂的总脂滴含量与寄主脂肪体的总脂滴含量显著相关（P=476．61-56．705 Ln（F），r2=0．9887；P代表幼蜂总脂滴含量，F代表小菜蛾预蛹脂肪体中总脂滴含量），但与血淋巴内总脂滴含量的相关性并不显著。对小菜蛾幼虫及预蛹的血淋巴及脂肪体和半闭弯尾姬蜂幼虫体内所含有机质进行抽提及GC-MS分析后结果发现，寄生及未寄生小菜蛾幼虫的血淋巴、脂肪体及半闭弯尾姬蜂幼蜂体内的有机质组分相似；但是，寄生与未寄生小菜蛾预蛹的脂肪体内有机质组分却存在很大差异。四、半闭弯尾姬蜂寄生对寄主取食、生长及代谢效率的影响被半闭弯尾姬蜂寄生后的小菜蛾幼虫的代谢率明显提高，且显著高于被菜蛾盘绒茧蜂寄生后寄主的代谢率。在小菜蛾-半闭弯尾姬蜂系统中，寄主的取食、生长及其他营养代谢相关参数受到一定程度的影响，但这些变化的显著性相对弱于小菜蛾-菜蛾盘绒茧蜂系统。被菜蛾盘绒茧蜂寄生后小菜蛾幼虫的相对生长率、取食量、排泄量显著降低，同化作用被显著抑制。寄主的呼吸作用，在寄生后的24 h内受抑制，但针对于整个寄生期而言，受抑制现象并不显著；在寄主和寄生蜂共生期间，寄主的消化食物转化率、摄入食物转化率降低，而近似消化率则上升。五、半闭弯尾姬蜂寄生对寄主部分内部器官变化的影响半闭弯尾姬蜂寄生后寄主幼虫内部器官的结构变化不明显。但是，菜蛾盘绒茧蜂寄生后的小菜蛾幼虫部分内部器官结构发生显著变化，如丝腺上的功能细胞在未完全转化成为功能型细胞之前发生凋亡，即分泌细胞丧失分泌功能。寄主脑内神经细胞的超微结构也发生一些变化，如核畸形或肿胀，电子密度发生变化，胞膜消失，内容物降解，染色质溶解，核仁呈降解状；细胞间隙变大，胞间质稀薄，胞间连接（如细胞桥粒等）消失；突触囊泡内内容物的泡状结构被破坏，数量减少，大小不均一；寄生后的神经分泌类物质较未寄生的幼虫明显减少等。六、半闭弯尾姬蜂个体发育及寄生因子研究半闭弯尾姬蜂蜂卵属于膜翅目型，卵表面无附属物。幼虫龄期分为4龄。蛹期分为两个阶段：第一阶段形似于5龄幼虫，但其体表会出现一些弱的突起；第二阶段形态呈裸蛹，其蛹体表各部位的着色顺序依次为：复眼-单眼-下颚-胸-腹-触角。首次发现半闭弯尾姬蜂的寄生因子除了毒液外，还携有另一个重要的寄生因子—多分DNA病毒（Diadegma semiclausum ichnivirus，DsIVs）。每个毒液囊的蛋白含量为1．016μg左右，大部分毒液蛋白的分子量集中在35-220 kDa范围内。DsIVs粒子是典型的姬蜂病毒，病毒粒子在萼细胞内获得第一层外膜，而在以出芽的方式进入萼区内腔时获得第二层外膜；成熟的病毒粒子呈圆柱状，横截面直径为130-150 nm而长度在300-400 nm之间，中间为高浓度的核质。半闭弯尾姬蜂卵巢由12根卵巢小管组成，属多滋式。超微结构表明卵巢管内配子囊中含多个细胞，但只有一个细胞可发育成为卵细胞，而其他细胞则分化为滋养细胞为卵细胞的发育提供营养，在卵细胞接近成熟的同时逐步消亡。刚羽化的雌蜂体内萼区为空，不含有成熟的卵；在羽化后2-3 d，萼区即充满了成熟的卵细胞。成熟卵细胞进入萼区后，被含DsIVs粒子的萼液包裹，但DsIVs粒子并不会附着到蜂卵绒毛膜表面。

论文目录

• 致射
• 前言
• 摘要
• Abstract
• 第一部分 文献综述
• 1 寄生蜂寄生对寄主免疫功能的影响
• 1.1 寄主的免疫组成
• 1.2 寄生蜂寄生对寄主免疫过程的影响
• 2 寄生蜂寄生对寄主营养、发育、代谢的调控
• 3 寄生蜂寄生对寄主神经系统的影响
• 4 国内小菜蛾寄生蜂系统研究概况
• 第二部分 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 昆虫与寄主植物
• 1.2 试剂
• 2 方法
• 2.1 寄生与寄生蜂的饲养
• 2.2 供试验昆虫的选取
• 2.3 幼虫血淋巴抽提
• 2.4 扫描及透射电镜处理
• 2.5 数据分析
• 第三部分 半闭弯尾姬蜂寄生对寄主的影响
• 第一章 半闭弯尾姬蜂寄生对寄主免疫功能的影响
• 第一节 寄主细胞免疫的变化
• 1.1.1 材料与方法
• 1.1.1.1 激光共聚焦扫描成像及透射电镜超微观察
• 1.1.1.2 小菜蛾血细胞原代培养
• 1.1.1.3 寄生蜂寄生后血细胞总数及各类型血细胞数的计算
• 1.1.1.4 寄生蜂寄生后血细胞延展能力检测
• 1.1.1.5 寄生蜂寄生后血细胞包囊能力检测
• 1.1.1.6 寄生蜂寄生后血细胞噬菌能力检测
• 1.1.1.7 寄生蜂寄生后血细胞基因组电泳分析
• 1.1.2 结果
• 1.1.2.1 小菜蛾血细胞的种类及结构
• 1.1.2.2 寄生对寄主血细胞数量的影响
• 1.1.2.3 寄生对寄主血细胞延展及包囊能力的影响
• 1.1.2.4 寄生对寄主血细胞噬菌能力的影响
• 1.1.2.5 寄生对寄主血细胞凋亡的影响
• 1.1.2.6 寄生对寄主造血器官的影响
• 1.1.3 讨论
• 第二节 寄主体液免疫的变化
• 1.2.1 材料与方法
• 1.2.1.1 细胞裂解液及细胞碎片的制备
• 1.2.1.2 酚氧化酶活性的测定
• 1.2.1.3 黑化作用
• 1.2.1.4 小菜蛾血淋巴的抑菌实验
• 1.2.1.5 小菜蛾感菌能力研究
• 1.2.2 结果
• 1.2.2.1 寄生对寄主PO活力的影响
• 1.2.2.2 寄生对小菜蛾血淋巴黑化作用的影响
• 1.2.2.3 寄生对小菜蛾血淋巴抑制细菌生长能力的影响
• 1.2.2.4 寄生对小菜蛾感菌能力的影响
• 1.2.3 讨论
• 第二章 半闭弯尾姬蜂寄生对寄主解毒酶及保护酶系统的影响
• 第一节 寄主解毒酶系统的变化
• 2.1.1 材料与方法
• 2.1.1.1 谷胱甘肽-S-转移酶（glutathione-S-transferase,GST）活性测定
• 2.1.1.2 多功能氧化酶（mixed-function oxidases,MFOs）酶活性测定
• 2.1.1.3 羧酸酯酶（carboxyesterase,CE）活性测定
• 2.1.1.4 乙酰胆碱酯酶（acethylcholinesterase.AchE）酶活性测定
• 2.1.2 结果
• 2.1.2.1 寄生对寄主GST活性的影响
• 2.1.2.2 寄生对寄主MFOs活性的影响
• 2.1.2.3 寄生对寄主CE活性的影响
• 2.1.2.4 寄生对寄主AchE活性的影响
• 2.1.3 讨论
• 第二节 寄主保护酶系统的影响
• 2.2.1 材料与方法
• 2.2.1.1 血淋巴过氧化物浓度变化
• 2.2.1.2 过氧化物歧化酶（superoxide dismutase.SOD）活性测定
• 2.2.1.3 过氧化氢酶（catalase.CAT）活性测定
• 2.2.1.4 过氧化物酶（peroxidase.POD）活性测定
• 2.2.2 结果
• 2.2.2.1 寄生对血淋巴过氧化物浓度的影响
• 2.2.2.2 寄生对保护酶活力的影响
• 2.2.3 讨论
• 第三章 半闭弯尾姬蜂寄生对寄主营养代谢的影响
• 第一节 寄主糖代谢的变化
• 3.1.1 材料与方法
• 3.1.1.1 血淋巴内海藻糖含量测定
• 3.1.1.2 糖原及总还原糖含量测定
• 3.1.1.3 糖原含量测定
• 3.1.1.4 血淋巴海藻糖酶酶活测定
• 3.1.1.5 糖原磷酸化酶酶活测定
• 3.1.2 结果
• 3.1.2.1 寄生对寄主血淋巴内海藻糖含量的影响
• 3.1.2.2 寄生对寄主总还原性糖类物质含量变化
• 3.1.2.3 寄生对寄主糖原磷酸化酶活性的影响
• 3.1.2.4 寄生对寄主海藻糖酶活性的影响
• 3.1.3 讨论
• 第二节 寄主蛋白代谢的变化
• 3.2.1 材料与方法
• 3.2.1.1 血淋巴蛋白分析
• 3.2.1.2 中肠总胰蛋白酶酶活的测定
• 3.2.1.3 中肠类胰蛋白酶酶活的测定
• 3.2.1.4 中肠总胰蛋白酶和类胰蛋白酶酶活酸碱度适应范围的检测
• 3.2.2 结果
• 3.2.2.1 寄生对寄主血淋巴蛋白含量及组分的影响
• 3.2.2.2 寄生对寄主蛋白酶活性的影响
• 3.2.2.3 寄生对寄主中肠蛋白酶酸碱环境适应性的影响
• 3.2.3 讨论
• 第三节 寄主脂代谢的变化
• 3.3.1 材料与方法
• 3.3.1.1 脂肪体重量测定
• 3.3.1.2 小菜蛾血淋巴和脂肪体中总脂滴浓度的测定
• 3.3.1.3 抽提物GC-MS分析
• 3.3.2 结果
• 3.3.2.1 寄生对小菜蛾脂肪体重量的影响
• 3.3.2.2 寄生对小菜蛾脂肪体脂滴含量的影响
• 3.3.2.3 寄生蜂脂滴含量与寄主组织脂滴含量的关系
• 3.3.2.4 脂肪酸GC-MS分析结果
• 3.3.3 讨论
• 第四章 半闭弯尾姬蜂寄生对寄主生长、取食及代谢效率的影响
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 取食行为观察
• 4.1.2 寄生对寄主体重的影响
• 4.1.3 取食量及排泄量测量
• 4.1.4 消化相关参数计算
• 4.2 结果
• 4.2.1 寄生对寄主取食行为有抑制作用
• 4.2.2 寄生对寄主营养消化相关系数的影响
• 4.3 讨论
• 第五章 半闭弯尾姬蜂寄生对寄主部分内部器官的影响
• 第一节 寄主脑的变化
• 5.1.1 材料与方法
• 5.1.2 结果
• 5.1.2.1 正常小菜蛾幼虫脑细胞超微结构
• 5.1.2.2 寄生对小菜蛾幼虫脑细胞结构及神经分泌物的影响
• 5.1.2.3 寄生对脑蛋白含量的影响
• 5.1.3 讨论
• 第二节 寄主丝腺的变化
• 5.2.1 材料与方法
• 5.2.2 结果
• 5.2.2.1 寄生对寄主小菜蛾丝腺形态的影响
• 5.2.2.2 寄生对寄主小菜蛾丝腺长度及蛋白浓度的影响
• 5.2.2.3 寄生对寄主小菜蛾丝腺蛋白组分的影响
• 5.2.3 讨论
• 第三节 寄主脂肪体结构的变化
• 5.3.1 材料与方法
• 5.3.2 结果
• 5.3.3 讨论
• 第四部分 半闭弯尾姬蜂幼期发育及寄生因子研究
• 第六章 半闭弯尾姬蜂卵巢结构及卵子发育
• 6.1. 材料与方法
• 6.2. 结果
• 6.2.1 卵巢概况
• 6.2.2 卵巢小管
• 6.2.2.1 末端纤丝
• 6.2.2.2 原卵区
• 6.2.2.3 生长区
• 6.2.3 萼区结构
• 6.3.讨论
• 第七章 半闭弯尾姬蜂幼蜂的幼期发育
• 7.1.材料与方法
• 7.1.1 卵观察
• 7.1.2 胚胎发育
• 7.2.结果
• 7.2.1 卵的发育
• 7.2.2 胚胎发育
• 7.2.3 幼虫
• 7.2.3.1 一龄幼虫
• 7.2.3.2 二龄幼虫
• 7.2.3.3 三龄幼虫
• 7.2.3.4 四龄幼虫
• 7.2.3.5 蛹
• 7.3.讨论
• 第八章 半闭弯尾姬蜂主要寄生因子研究
• 8.1.材料与方法
• 8.1.1 光镜及透射电镜观察
• 8.1.2 DNA琼脂糖凝胶电泳
• 8.1.3 毒腺、杜氏腺分泌物蛋白SDS-PAGE电泳
• 8.2.结果
• 8.2.1 半闭弯尾姬蜂萼液内病毒粒子的基因组分析
• 8.2.2 毒液器官
• 8.2.3 杜氏腺
• 8.3.讨论
• 附章
• 第九章 半闭弯尾姬蜂、菜蛾盘绒茧蜂的雄性生殖系统结构
• 9.1.材料与方法
• 9.2.结果
• 9.2.1 半闭弯尾姬蜂雄性生殖系统结构
• 9.2.1.1 概况
• 9.2.1.2 精巢和附腺的超微结构
• 9.2.1.3 精巢及附腺内容物蛋白分析
• 9.2.2 菜蛾盘绒茧蜂雄性生殖系统结构
• 9.2.2.1 概况
• 9.2.2.2 精巢和附腺的超微结构
• 9.2.2.3 精巢及附腺内容物蛋白分析
• 9.3.讨论
• 第五部分 总结
• 一、总讨论
• 二、创新点
• 三、不足之处
• 四、未来的研究方向
• 第六部分 参考文献
• 附 博士学位攻读期间发表学术论文目录