苏云金芽胞杆菌Cry7Ba1晶体蛋白溶解性改良

论文摘要

苏云金芽胞杆菌华中亚种YBT978产生大分子量晶体蛋白Cry7Ba1,与其它典型晶体蛋白不同的是Cry7Bal需要在强碱性缓冲液中（pH11.5）才能溶解,常规杀虫晶体蛋白在弱碱性缓冲液中就能溶解,并且之前相关研究表明只有溶解后的Cry7Bal才能表现出对小菜蛾的毒力(LC50:1.33μg/mL)。Cry1Ac和Cry1C是Cry1类晶体蛋白,能形成典型的菱形晶体,并且其晶体蛋白在弱碱性条件下（pH9.5）能有效溶解,从而发挥其杀虫活性。本试验为了找出晶体溶解性与蛋白结构的关系,分别用Cry1Ac和Cry1C晶体蛋白的N端和C端替换Cry7Ba1的N端和C端,结果发现替换后的4个重组蛋白都不能形成完好的晶体,只能形成包涵体。当Cry7Ba1的C端被Cry1Ac和Cry1C的C端替换后,重组蛋白0184,0185能像Cry1Ac和Cry1C等其它晶体蛋白一样在弱碱性条件下（pH9.5）有效溶解,而且其毒力没有发生明显变化(LC50分别为:1.32μg/mL,1.39μg/mL);当Cry7Ba1的N端被Cry1Ac和Cry1C的N端替换后,其重组蛋白0181,0183溶解性没有发生明显变化,仍需要在强碱性缓冲液中才能溶解。本研究结果表明Cry7Ba1晶体蛋白的形成与C端结构相关,并且Cry7Ba1晶体蛋白难溶的特性是由其C端结构决定的,其弱碱性下难溶解的性质决定了它的杀虫活性难以发挥。本试验通过改变Cry7Ba1晶体蛋白C端结构来改善该晶体蛋白的溶解性,从而发挥其杀虫活性,为该晶体蛋白的生物防治应用提供了可能。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 苏云金芽胞杆菌的简介
• 1.2 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白及其基因
• 1.3 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因的命名与分类
• 1.4 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的杀虫机制
• 1.5 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的结构与功能
• 1.5.1 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的一级结构与功能
• 1.5.2 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的空间结构与功能
• 1.6 伴胞晶体的形成
• 1.7 杀虫晶体蛋白C端及二硫键的功能
• 1.8 辅助蛋白对杀虫晶体蛋白基因表达和伴胞晶体形成的影响
• 1.9 无毒晶体蛋白的存在原因
• 1.10 杀虫晶体蛋白的溶解及剪切
• 1.11 晶体蛋白溶解性与杀虫活性的关系
• 1.12 目标昆虫对苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的抗性以及防治措施
• 2 研究目的与意义
• 3 材料和方法
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌株和质粒
• 3.1.2 培养基及生长条件
• 3.1.3 引物以及寡聚脱氧核糖核酸
• 3.1.4 试剂和仪器
• 3.1.5 供试昆虫
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 质粒 DNA的少量抽提与纯化
• 3.2.2 DNA片段的回收
• 3.2.3 重组 DNA的转化
• 3.2.4 PCR扩增片断的克隆与测序
• 3.2.5 大肠杆菌转化子的质粒快检方法
• 3.2.6 PCR扩增
• 3.2.7 SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 3.2.8 杀虫晶体蛋白质的定量
• 3.2.9 晶体蛋白的溶解性测定
• 3.2.10 生测用晶体蛋白溶液的制备
• 3.2.11 生物测定
• 4 结果与分析
• 4.1 出发菌株晶体蛋白的性质
• 4.2 分别用cry1Ac和cry1C基因编码区的5’端和3’端分别替换cry7Ba1的5’端和3’端构建重组质粒
• 4.3 重组质粒电转 BMB171后的酶切验证
• 4.4 重组基因在苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171中表达
• 4.5 重组菌株晶体的显微镜检测
• 4.6 重组基因表达的晶体蛋白溶解性
• 4.7 重组晶体蛋白毒力测定
• 4.7.1 蛋白质浓度的测定
• 4.7.2 重组晶体蛋白毒力测定
• 5. 讨论
• 参考文献
• 致谢