论文摘要
乙酰乳酸合酶（也称乙酰羟酸合酶acetohydroxyacid synthase,AHAS）是植物、真菌和细菌细胞内支链氨基酸Val、Leu、Ile生物合成过程中关键酶,是乙酰乳酸合酶抑制剂类除草剂如磺酰脲类、咪唑啉酮类、嘧啶水杨酸和磺酰氨类的作用靶标。本文从长期使用甲磺隆的土壤中分离到1株抗甲磺隆的菌株Lm10,菌株Lm10对甲磺隆的最高耐受浓度达到14,000μmol/L。经形态、生理生化特性测定及其16SrDNA序列和系统进化树的分析,该菌被鉴定为假单孢菌（Pseudomonas sp.）。该菌的最适温度为30℃,最适生长pH是7.0;装液量小于100mL/250mL时,通气量的改变对抗性菌Lm10的生长影响不大;可以很好的利用麦芽糖,葡萄糖;在以葡萄糖为碳源时,以有机氮为氮源生长较好,在供试的几种无机氮源中,Lm10对NH4NO3利用最好;该菌株对氨苄青霉素、四环素、链霉素有抗性。且菌株对各种乙酰乳酸合酶抑制剂类除草剂具有交叉抗性。菌株Lm10的AHAS酶的Km为18.38 mM,Vmax为0.568 mmol·h-1。在甲磺隆高达2500μmol/L时菌株Lm10的AHAS酶粗酶液酶活仍为无甲磺隆时粗酶液酶活的50%。菌株Lm10的AHAS最适温度30℃,最适pH在6.5左右,终产物Val对AHAS酶具有反馈抑制作用。AHAS酶对测试的几种有机溶剂不敏感;在供试的几种金属离子中,当浓度为2mmol·L-1时,Fe2+、Ca2+对酶活都有明显的促进作用,Ni2+、Fe3+离子对酶活影响不大,Cu2+对酶活表现抑制作用。通过PCR的方法,扩增得到了菌株Lm10（Pseudomonas sp.）乙酰乳酸合酶（Acetolactate synthase,ALS）的基因全序列。测序和比对分析结果表明该片段包含二个基因克隆ilvI、ilvH,其基因序列全长分别为1725bp、492bp,分别编码含有575、164个氨基酸残基的多肽链。将PCR产物分别连接到表达载体pET29a（+）上构建了重组质粒pET-I、pET-H和pET-IH,实现了ilvI、ilvH基因的分别高效表达;而含有重组质粒pET-IH的转化子,只在67kD附近出现很强的表达条带,没有发现小亚基的表达条带,这可能是由于小亚基位于大亚基后面,大肠杆菌的翻译系统不能识别其核糖体结合位点。通过对粗酶液酶活试验结果表明Lm10的ilvI基因表达的AHAS大亚基对甲磺隆有很强的抗性,活性与对照相比高5倍以上,说明菌株Lm10的ilvI基因表达的AHAS大亚基具有催化活性。通过对ilvI、ilvH序列比较,发现抗甲磺隆菌株Lm10与敏感菌株KT2440的ilvH在氨基酸水平上无差异,而ilvI则有6个氨基酸位点差异,分别为N134H、P135A、T136S、V210I、Y214F和W486S,有必要通过点突变等技术作进一步分析这些位点突变与乙酰乳酸合酶对磺酰脲除草剂抗性产生之间的关系。