黄粉虫酪氨酸羟化酶原核表达、活性测定及其在黑化过程中的作用

论文摘要

黑化反应在昆虫的表皮鞣化、色素形成以及免疫防御过程中起着重要的作用。黑化反应是酪氨酸在酶的作用下首先羟化为3,4-二羟苯丙氨酸（DOPA）,然后DOPA再在相关酶的催化作用下转化为儿茶酚类及其衍生物,最终形成色素的过程。酪氨酸羟化成多巴的反应是黑化反应的限速步骤,可在两种酶的作用下进行:酚氧化酶（phenoloxidase, PO, EC 1.14.18.1）和酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase, TH, EC 1.14.16.2）。其中PO广泛存在于鳞翅目、鞘翅目、双翅目、蜚蠊目和直翅目等昆虫的各个发育期,且对其研究较为深入。而对昆虫TH的研究则主要集中在双翅目及鳞翅目类昆虫,尤以黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）研究最深入,对鞘翅目昆虫TH基因及其功能研究极少。对鞘翅目昆虫TH基因及其功能研究较少。本研究以鞘翅目昆虫黄粉虫（Tenebrio molitor）为研究对象,成功构建黄粉虫酪氨酸羟化酶（TmTH）基因的原核表达载体,并表达出有活性的酶蛋白,利用高效液相色谱法测定产物DOPA的含量,通过抑制TH酶活性,以PO作为参照,初步探讨TmTH在黄粉虫黑化过程中的生理功能。为进一步研究鞘翅目昆虫的表皮形成机理及免疫黑化打下基础,同时也为研究昆虫病虫害防治提供理论依据。本实验主要内容及结果如下:1、黄粉虫酪氨酸羟化酶基因表达载体构建与原核表达:将TmTH编码区克隆到表达载体pET28a+中,并在大肠杆菌BL21中进行了IPTG诱导浓度表达及诱导时间表达,结果表明1mM IPTG诱导菌体表达5h时,表达出的蛋白量最大。经SDS-PAGE分析以及western-blot分析显示诱导表达出活性蛋白的大小约为62 kD,这为进一步研究TmTH体外酶学性质及相关功能等方面的研究提供材料。2、高效液相色谱法测定产物多巴的含量:将原核表达出的活性TmTH以及黄粉虫幼虫不同组织提取物的TmTH样品,在TmTH催化反应体系中反应10min,用高氯酸终止酶反应,应用高效液相色谱紫外检测法测定反应生成的L-DOPA含量,计算酶的活性。结果表明3ml原核表达菌体酶的比活性为10.028 U/mg,TH抑制剂3-碘-L-酪氨酸（3-iodo-tyrosine,3IL）明显抑制了产物L-DOPA的生成。3、抑制酪氨酸羟化酶活性对黄粉虫幼虫血淋巴黑化及凝集功能的影响:幼虫血淋巴与不同浓度的PO抑制剂PTU及TH抑制剂3IL混合反应,室温下拍照并记录血淋巴的黑化时间变化,同时利用倒置显微镜拍摄黑化前后的血淋巴凝集状况。结果表明3IL和PTU均有不同程度的抑制作用,且抑制效果随着抑制剂浓度增大而越明显,其中3IL处理的血淋巴,其黑化时间稍微延长,且凝集块明显减少。4、抑制体内酪氨酸羟化酶活性对黄粉虫幼虫表皮黑化反应的影响:配制含有不同抑制剂浓度的生理液注射不同发育体色的黄粉虫末龄幼虫,观察记录注射创口的黑化时间。选取白色幼虫进行注射,并记录其白色表皮发育为黄褐色表皮的时间。剥离的白色幼虫表皮组织在不同条件下培养,进一步研究TmTH在表皮黑化过程中作用,48h后倒置显微镜下观察表皮颜色变化。PTU和3IL抑制结果表明PO和TmTH均参与了表皮色素沉着。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一章 综述
• 1 酪氨酸羟化酶
• 2 酚氧化酶
• 3 昆虫黑化与表皮着色
• 4 研究意义与展望
• 第二章 黄粉虫酪氨酸羟化酶基因表达载体构建与原核表达
• 1 材料和试剂
• 2 方法
• 3 结果与分析
• 4 讨论
• 第三章 高效液相色谱法测定酶催化生成多巴的含量
• 1 材料和试剂
• 2 方法
• 3 结果与分析
• 4 讨论
• 第四章 抑制酪氨酸羟化酶活性对黄粉虫幼虫血淋巴黑化及凝集功能的影响
• 1 材料和试剂
• 2 方法
• 3 结果与分析
• 4 讨论
• 第五章 抑制体内酪氨酸羟化酶活性对黄粉虫幼虫表皮黑化的影响
• 1 材料和试剂
• 2 方法
• 3 结果与分析
• 4 讨论
• 第六章 小结
• 参考文献
• 缩略词表
• 附录一 pMD19-T 载体质粒图谱
• 附录二 pET28a（+）质粒图谱
• 攻读学位期间本人出版或公开发表的论著、论文
• 致谢