杨树不定根发育的基因表达调控研究

论文摘要

生根性状在杨树遗传改良中占有重要地位,研究杨树硬枝插穗不定根发育的分子机理不仅有理论意义,而且有潜在应用价值。插穗不定根发育是一个复杂的生物学过程,本研究以南林895杨（Populus×euramericana cv.‘Nanlin895’）硬枝插穗为材料,利用杨树全基因组芯片剖析插穗不定根发育的分子生物学事件,挖掘和鉴定不定根发育相关基因及其功能。同时,运用“遗传基因组学”策略,进行杨树不定根发育的eQTLs分析,探索基因表达调控与表型之间的相关关系。本论文主要结果如下:利用15张杨树全基因组芯片检测了杨树硬枝插穗生根过程中5个发育阶段的基因表达变化,基于SAM软件中的Mulclass算法共筛选到14630个基因在不定根发育过程中显著差异表达。运用实时定量RT-PCR技术对芯片检测结果进行了验证,33个验证基因在两种方法中的表达结果具有极高的吻合度,表明了杨树不定根基因组芯片实验及其数据分析具有较高的准确性和可靠性。整合多个公共数据库中的杨树分子生物学资源对筛选到的差异表达基因进行相关的生物学功能注释,并列举和分析了部分可能对不定根发育研究有重要意义的基因,这为杨树不定根发育相关基因的克隆提供依据,也为进一步开展插穗不定根分子发育生物学研究奠定了基础。基于杨树全基因组表达谱芯片分析,分离克隆了10个杨树不定根发育相关基因的全长cDNA序列,以及1个Aux/IAA基因启动子序列,并对这些基因或启动子的结构及其进化关系进行了生物信息学分析。构建了PeAux/IAA1、PeAux/IAA2、PeAux/IAA3、PeAux/IAA4、PeABP1、PeRHD31、PeRHD32、PeRHD33等8个基因的过量表达载体,以及1个启动子的GUS表达载体,采用农杆菌介导法进行表达载体在拟南芥（Arabidopsis thaliana）、南林895杨和欧洲杂种山杨T89（Populus tremula×Populus tremuloides Michx. clone T89）等受体材料中的遗传转化,并对获得的转基因植株进行了初步检测和表型观察。在已完成的杨树插穗生根性状QTLs定位图谱基础上,结合不定根发育的全基因组芯片检测数据,进行了杨树插穗不定根发育的eQTLs分析,探讨插穗生根性状相关QTLs的分子生物学基础。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 根系发育生物学研究进展
• 1.1 生长素调控不定根发生发育的分子机理
• 1.2 不定根发生过程中的特异表达基因
• 1.3 林木插穗生根机理研究
• 2 林木分子生物学研究进展
• 2.1 杨树全基因组测序计划
• 2.2 林木分子生物学资源
• 2.3 林木典型生长发育现象的分子基础
• 2.3.1 次生生长与应力材的形成
• 2.3.2 林木开花调控机制与季节性休眠
• 2.3.3 转基因林木改良特性
• 2.4 林木遗传基因组学和关联基因组学
• 3 基因芯片技术及其应用
• 3.1 基因芯片概述
• 3.2 基因芯片在林木生物学研究中的应用
• 3.3 Affymetrix 基因芯片技术
• 3.3.1 寡聚核苷酸原位光刻技术
• 3.3.2 独特的PM-MM 探针设计
• 3.3.3 严格的质控标准
• 3.4 杨树全基因组芯片
• 4 本研究的立题依据及技术路线
• 4.1 立题依据
• 4.2 南林895 杨背景介绍
• 4.3 本研究的技术路线
• 第二章 杨树不定根发育的全基因组芯片检测和质控评估
• 1 研究材料
• 2 实验方法
• 2.1 插穗生根水培试验
• 2.2 总RNA 提取与纯化
• 2.3 基因芯片杂交实验
• 2.4 芯片杂交实验质控分析
• 3 结果与讨论
• 3.1 芯片实验设计
• 3.2 插穗生根材料总RNA 提取
• 3.3 杨树全基因组芯片的质控评估
• 3.4 生物学重复样本相关性分析
• 3.5 插穗不定根发育芯片实验的取样策略
• 4 小结
• 第三章 杨树全基因组芯片数据分析
• 1 研究材料
• 2 实验方法
• 2.1 基因表达谱数据分析
• 2.2 芯片结果实时定量RT-PCR验证
• 3 结果与分析
• 3.1 基因芯片数据的预处理和归一化
• 3.2 显著差异表达基因筛选
• 3.3 杨树全基因组芯片结果的验证
• 3.3.1 内对照基因的确定
• 3.3.2 基因芯片结果的实时定量RT-PCR 验证
• 3.4 差异表达基因的功能注释
• 3.4.1 GO 功能分类
• 3.4.2 KEGG 代谢通路分析
• 3.4.3 显著差异表达基因染色体定位
• 4 小结
• 第四章 杨树不定根发育差异表达基因功能分析
• 1 生长素信号传导相关基因
• 2 泛素降解途径相关基因
• 3 与小RNA产生及其功能发生相关基因
• 4 转录因子
• 4.1 SCR与SHR转录因子
• 4.2 NAC转录因子
• 4.3 MYB转录因子
• 4.4 WRKY转录因子
• 5 其他根系发育相关基因
• 5.1 LBD基因
• 5.2 RHD基因
• 5.3 LRP1基因
• 5.4 ALF基因
• 5.5 CLV基因
• 5.6 STM基因
• 第五章 杨树不定根发育相关基因的克隆、表达载体构建及其遗传转化
• 1 研究材料
• 2 实验方法
• 2.1 不定根发生发育相关基因的克隆
• 2.1.1 相关基因的同源克隆
• 2.1.2 相关基因的RACE 克隆
• 2.1.3 启动子克隆
• 2.2 克隆基因的表达分析
• 2.3 植物表达载体构建
• 2.3.1 TOPO PCR 反应
• 2.3.2 pENTR/D-TOPO Cloning （BP reaction）
• 2.3.3 Gateway 目的载体准备
• 2.3.4 LR 反应（LR reaction）
• 2.4 遗传转化
• 2.4.1 农杆菌感受态细胞的制备与转化
• 2.4.2 花器官浸泡法转化拟南芥
• 2.4.3 叶盘法转化南林895杨
• 2.4.4 茎段法转化杂种山杨T89
• 3 结果与分析
• 3.1 克隆基因的序列分析及功能预测
• 3.1.1 Aux/IAA 基因功能分析
• 3.1.1.1 杨树 Aux/IAA 基因的克隆与序列分析
• 3.1.1.2 PeAux/IAA 基因在插穗生根中的表达分析
• 3.1.1.3 PeAux/IAA2 基因启动子序列分析
• 3.1.2 ABP1 基因克隆与功能分析
• 3.1.3 RHD3 基因克隆与功能分析
• 3.1.4 杨树AGO 基因克隆与功能分析
• 3.1.5 PeNAC1 基因克隆与功能分析
• 3.2 表达载体构建及其遗传转化
• 3.2.1 BP 反应阳性克隆检测
• 3.2.2 LR 反应阳性重组子检测
• 3.3 转基因植株的初步检测与表型观察
• 3.3.1 转基因植株的PCR 检测
• 3.3.2 转基因植株的表型观察
• 4 小结
• 第六章 杨树不定根发育的eQTLs 分析
• 1 研究材料
• 2 实验方法
• 2.1 遗传图谱构建与QTL定位
• 2.2 生根性状eQTLs分析
• 3 结果与分析
• 3.1 生根性状QTLs定位
• 3.2 生根性状eQTLs表达谱分析
• 3.2.1 显著差异表达eQTLs筛选
• 3.2.2 生根数（TNR）性状eQTLs分析
• 3.2.3 最大根长（MRL）性状eQTLs分析
• 3.3 不定根发生eQTLs的遗传分析
• 4 小结
• 参考文献
• 详细摘要