siRNA干扰B因子基因的表达及其抑制大鼠脉络膜新生血管的实验研究

论文摘要

目的:在眼部疾病中,血管增生过度是一大类致盲性眼病的根本原因,其中脉络膜新生血管性疾病占据较大比例。脉络膜新生血管（Choroidal Neovascularization, CNV）的生长及其所导致的出血、渗出、增生等是多种致盲眼病的主要病理过程。血管新生是多种分子共同作用的结果,而以往的研究多是针对单分子来控制血管新生,这些方法虽然显示出一定抑制作用,但毕竟单分子作用是微弱的,并且都不能从根本上解决CNV的发生及其复发问题,故抗血管新生的作用也是有限的。最新研究表明补体活化的旁路途径可能是激光诱导大鼠CNV生成的相关因素的根本原因。为了进一步探讨旁路途径在激光诱导的CNV生成中的作用,本研究利用了旁路途径中一个重要因子B因子（complement factor B, CFB）作为阻断旁路途径的靶点,观测补体活化的旁路途径对CNV生成及其相关生长因子表达的抑制作用。方法:1 CFB-siRNA表达载体的构建1.1以人CFB mRNA为模板,设计与大鼠同源的、针对CFB基因编码区的CFB-siRNA序列,并在体外转录合成。1.2双酶切质粒pRNAT-U6.1/Neo,与CFB-siRNA链连接,构建CFB-siRNA表达载体,转化至感受态细胞（E.coli）后采用PCR、双酶切（BamHⅠ和HindⅢ）、胶回收、连接后得到重组质粒pRNAT-U6.1/CFB-siRNA,并进行测序鉴定和PCR鉴定。1.3用电转染技术将重组质粒pRNAT-U6.1/CFB- siRNA转染人脐静脉内皮细胞ECV-304（电转参数:电容:900μF,电压0.2kv,电阻:+∞,时间:70ms,脉冲次数:1次）,命名为CFB-siRNA组;将等量空质粒以同样条件转染ECV-304,命名为空质粒组;未转染细胞命名为正常对照组。1.4转染后继续培养48h后于倒置荧光显微镜下观察质粒的转染效率。收集各组ECV-304进行RT-PCR,测定CFB mRNA的表达,并用Bandleader凝胶图像分析软件对凝胶电泳条带进行灰度值分析;四甲基偶氮唑蓝法（MTT）检测各组细胞的生长抑制率;流式细胞仪检测细胞周期。1.5统计学方法:凝胶电泳条带灰度值用±s表达,两个样本均数的比较用t检验;计数资料用χ2检验。所有数据均用SAS软件包统计。P<0.05为差异有显著性意义。2重组CFB-siRNA抑制激光诱导的大鼠脉络膜新生血管生成的体内实验2.1 CNV模型的建立:健康成年棕色挪威（Brown Norway,BN）大鼠42只,激光光凝方式建立CNV动物模型,随机分为尾静脉注射组,玻璃体腔注射组,视网膜下腔注射组,对照组。三种不同的注射方式组分别设有相应的空质粒注射组。共7组,6只/组。2.2光凝后第1、3、5天分别给予各组的大鼠进行注射,对照组光凝后不给予任何干预。2.3玻璃体注射组和视网膜下腔注射组在注射后第1、2、3天观察其晶体、玻璃体及视网膜情况。2.4光凝后第7天、第14天行荧光素眼底血管造影（fundus fluorescein angiography, FFA）,根据荧光渗漏程度对各光凝斑评分来检测新生血管的生成情况。2.5免疫组织化学法从蛋白水平检测各组大鼠脉络膜内血管生成相关因子:血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）、第Ⅷ因子（factorⅧ）的表达情况。Imagepro plus图像分析软件进行吸光度值检测。2.6统计学方法:计数资料用χ2检验。免疫组化结果的吸光度值（A）用±s表达。所有数据均用SAS软件包统计。P<0.05为差异有显著性意义。结果:1 CFB-siRNA表达载体构建1.1将CFB-siRNA定向插入到pRNAT-U6.1的BamHⅠ和HindⅢ内切酶位点,测序结果显示同设计序列完全相同,表明人CFB-siRNA真核表达载体构建成功。1.2倒置荧光显微镜下,转染CFB-siRNA、空质粒的ECV-304细胞均可看见清晰的绿色荧光,说明转染成功。1.3收集ECV-304细胞,提取RNA,RT-PCR检测重组质粒对CFB mRNA的抑制率,结果显示,与正常对照组和空质粒组相比,CFB-siRNA组对CFB有明显的抑制效果（P<0.05）。1.4 MTT法检测CFB-siRNA组的细胞在24h的抑制率为23.45%,48h的抑制率为33.48%,72h的抑制率为45.49%,而空质粒组对ECV-304细胞生长没有影响。1.5流式细胞仪结果显示,CFB-siRNA对ECV-304的抑制作用主要是将ECV-304的生长阻滞在细胞周期的间期G1期。2重组CFB-siRNA抑制激光诱导的大鼠脉络膜新生血管生成的体内实验2.1健康成年BN大鼠42只,激光光凝方式建立CNV模型,随机分为7组,每组6只:（1）CFB-siRNA尾静脉注射组;（2）空质粒尾静脉注射组;（3）CFB-siRNA玻璃体腔注射组;（4）空质粒玻璃体腔注射组;（5）CFB-siRNA视网膜下腔注射组;（6）空质粒视网膜下腔注射组;（7）对照组（光凝后不予处理）。2.2玻璃体注射组和视网膜下腔注射组在注射后第1、2、3天观察晶体、玻璃体均透明,无明显炎性反应,视网膜在位。2.3各光凝斑荧光渗漏程度评分结果显示:CFB-siRNA尾静脉注射组与其它各组相比荧光渗漏程度轻,且差别有显著意义（P<0.05）。2.4免疫组化结果:CFB-siRNA尾静脉注射组VEGF、factorⅧ的阳性表达强度不同时间点之间无显著差异（P>0.05）,而与同时间点其它各组相比明显降低,且差异有显著意义（P<0.05）。其它各组不同时间点VEGF、factorⅧ的阳性表达强度,光凝后14d显著强于光凝后7d,差异有显著性（P<0.05）。结论:1体外重组CFB-siRNA可高效地沉默CFB基因的表达,为第二部分的体内试验提供了工具。2经电转染方法成功的将重组CFB-siRNA转染ECV- 304,并在一定程度上抑制ECV-304细胞的增殖。3激光光凝的方法成功诱导BN大鼠CNV模型,方法简单易行,成模时间短,成模率高,可用来模仿人类CNV病变进行防治研究。4重组CFB-siRNA能有效的抑制体内CNV的生成,并且从蛋白水平证明能下调VEGF及factorⅧ的表达水平。5尾静脉快速注射重组CFB-siRNA对于CNV的抑制效果最佳。6本研究为脉络膜新生血管性疾病的基因治疗方案,提供了新的可靠实验数据和理论依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一部分 B 因子siRNA 基因表达载体的构建
• 前言
• 材料、设备与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第二部分 B 因子-siRNA 抑制激光诱导的大鼠脉络膜新生血管生成的体内试验
• 前言
• 材料、设备与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 个人简历