对非核苷类逆转录酶抑制剂耐药型HIV-1药理模型的建立

论文摘要

艾滋病又称获得性免疫缺陷综合症（acquired immune- odeficiency syndrome, AIDS）,是由人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus, HIV）所引起的致命性慢性传染病。HIV主要侵犯、破坏辅助性T淋巴细胞,导致机体细胞免疫功能受损,最后并发各种严重机会性感染和肿瘤。艾滋病目前尚无特效治疗方法,早期抗病毒治疗是关键。既能缓解病情,减少机会性感染和肿瘤,又能预防或延缓AIDS相关疾病的发生,延长生存期,提高生活质量。根据HIV生命周期中的主要环节,抗HIV药物分为逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、整合酶抑制剂和融合抑制剂四大类。逆转录酶抑制剂是最早用于临床的抗HIV药物,包括核苷类和非核苷类两种。其中非核苷类逆转录酶抑制剂由于其低毒高效而受到关注,但由于其抗耐药屏障作用较弱,使得这类药物在应用一段时间后很容易发生耐药。因此,研究和开发具有抗耐药作用的新型非核苷类药物成为发展方向,而与之相应的药物筛选方法成为关键环节。目的:在细胞水平建立三种针对HIV-1复制环节的药物筛选模型,其对现有的非核苷类逆转录酶抑制剂（non-nucleoside reverse- transcriptase inhibitors, NNRTIs）具有特异的耐药性,可为新型NNRTIs研发提供筛选平台。方法:（1）应用PCR法扩增含突变位点K103N,K103N/P225H,K103N/G190A的三段目的片段,长度为1.5Kb,介于ApaI与AgeI酶切位点间。（2）用限制性内切酶ApaI和AgeI分别切割目的片段和HIV-1质粒。（3） T4连接酶将含相同粘末端的目的片段与HIV-1质粒进行连接,构建新的含突变位点的HIV-1质粒,分别命名为HIV-K103N、HIV-K103N/P225H、HIV-K103N/G190A。（4）将HIV-K103N、HIV- K103N/P225H、HIV-K103N/G190A分别与水泡性口膜炎病毒的外壳糖蛋白的质粒（Vesicular stomatitis virus glycoprotein, VSV-G）在293细胞中共转染,组装成假病毒模型,分别命名为VSVG/HIV-K103N、VSVG/HIV- K103N/P225H、VSVG/HIV-K103N/G190A,模型携带的荧光素酶报告基因的表达水平可以反映HIV-1的复制程度。（5）对三种假病毒模型按不同的稀释比（1:10,1:25,1:50,1:100,1:200和1:400）稀释后感染293细胞,用FB15荧光检测器测定细胞中荧光素酶的相对活性（Relative Luciferase activity units, RLUs）,并绘制病毒滴度-荧光素酶相对活性曲线。（6）用核苷类阳性对照药齐多夫定（zidovudine, AZT）和司他夫定（stavudine, d4T）;非核苷类阳性对照药奈韦拉平（nevirapine, NVP）和依非韦伦（efavirenz, EFV）分别对三种假病毒模型进行抑制性检测,并用野生株HIV-1假病毒作对照,验证模型的可靠性。结果:（1）通过PCR成功扩增出1.5Kb的目的片段,再通过分子克隆方法构建新的HIV-1质粒（HIV-K103N、HIV- K103N/P225H、HIV-K103N/G190A）,经过DNA测序分析证实突变引入成功。（2）对假病毒模型滴度检测证实三种假病毒都具有高度感染能力,VSVG/HIV-K103N和VSVG/HIV- K103N/P225H按1:10稀释后感染293细胞,其RLUs达到3x107,这也是FB15荧光检测器的最大检测值;VSVG/HIV-K103N/G190A按1:10稀释后感染293细胞,其RLUs也达到2x107。病毒滴度-荧光素酶相对活性曲线可以清楚的反应出HIV-1复制水平与荧光素酶报告基因表达水平间的剂量依赖效应。因此,三种假病毒可用于针对HIV-1复制环节的药物筛选模型。（3） VSVG/HIV-K103N、VSVG/HIV- K103N/P225H和VSVG/HIV- K103N/G190A以及VSVG/HIV-wild可有效的在细胞内进行复制,非核苷类阳性对照药NVP和EFV可有效抑制VSVG/HIV-wild,其IC50分别为0.024±0.006μmol/L和0.83±0.21nmol/L ,与文献中应用其它方法得出的IC50（0.046μmol/L和1.3 nmol/L）基本一致。NVP也可有效抑制VSVG/HIV-K103N、VSVG/HIV-K103N/P225H和VSVG/HIV-K103N/G190A,但IC50明显升高,分别为1.89±0.92μmol/L、5.13±0.58μmol/L和27.61±4.796μmol/L,与文献中应用其它方法得出的IC50（2.21μmol/L、6.12μmol/L和23μmol/L）相一致。EFV也可有效抑制VSVG/HIV-K103N、VSVG/HIV-K103N/P225H和VSVG/HIV- K103N/G190A,IC50也明显升高,分别为16.7±6.0nmol/L、0.1103±0.0328μmol/L和0.1697±0.1147μmol/L,与文献中应用其它方法得出的IC50 （26nmol/L、0.1742μmol/L和0.277μmol/L）相符合。计算三种假病毒对NVP和EFV的耐药倍数（耐药株病毒IC50/野生株病毒IC50）,为15～1000倍,说明此三种假病毒模型对NNRTIs产生耐药性。（4）核苷类阳性对照药AZT和d4T可有效抑制VSVG/HIV-K103N、VSVG/HIV-K103N/P225H和VSVG/HIV- K103N/G190A以及VSVG/HIV-wild,其IC50未有明显变化,约为9.9±1.4nmol/L和0.153±0.034μmol/L,与文献中报道的活病毒IC50,以及实验室应用其它方法得出IC50相符合,说明此三种假病毒模型对NRTIs不产生耐药性。结论:HIV-1假病毒模型是针对HIV-1复制环节的细胞水平药理筛选模型,其携带的荧光报告基因的表达水平可以反映HIV-1复制的程度;通过PCR及分子生物学方法将文献报道的针对NNRTIs耐药的K103N、K103N/P225H和K103N/G190A三组突变位点定点引入HIV-1假病毒模型,构建出新的假病毒模型;通过核苷类及非核苷类阳性对照药对模型的验证,证实模型对NNRTIs有特异的耐药性,可为新型非核苷类化合物的研发提供一个安全、高效、稳定、快速的筛选平台。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究论文 对非核苷类逆转录酶抑制剂耐药型HIV-1药理模型的建立
• 前言
• 实验材料
• 实验方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 参考文献
• 综述 HIV-1 逆转录酶耐药性的研究现状
• 致谢
• 个人简历