论文摘要
苏云金杆菌是一类非常重要的昆虫病原体，它能产生特异性的杀虫晶体蛋白，对农业上和生物医学上的许多害虫具有毒杀作用。Bt毒蛋白（或内毒素Bt-toxin）基因是世界范围内广泛使用的抗虫基因，2005年全球转Bt基因作物的种植面积达263,000,000 hm2。虫害是杨树造林生产上面临的一大难题。虽然利用Bt基因转化欧洲黑杨、雄性毛白杨、美洲黑杨、欧美杨等获得了成功，但受多种因素的影响，至今未见转Bt基因抗虫杨用于造林生产的报道，转Bt基因抗虫杨的研究仍是杨树抗虫育种的热点。中嘉8号杨是湖北省重点推广的杨树优良无性系，但虫害发生较严重。本研究通过根癌农杆菌介导的叶盘法，将经过人工改造的苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因BtCrylA成功导入中嘉8号杨，并得到转基因杨树再生植株。经PCR检测、ELISA检测、SDS-PAGE鉴定和MTT法检测证实了BtCrylA基因在中嘉8号杨中的整合与表达。用中嘉8号杨转Bt基因植株叶片饲喂杨扇舟蛾幼虫，结果表明转基因杨植株具有明显的抗虫活性。为探索培育杨树抗虫新品系开辟了一条新途径。本研究的主要结论如下：以水培法萌芽的叶片为外植体，研究了中嘉8号杨组织培养技术。愈伤组织诱导的最佳培养基为：MS+BA1.0 mg／L+2,4-D 0.1 mg／L+蔗糖30g／L+琼脂6.5g／L。经方差分析，2,4-D和BA两因素对愈伤组织分化不定芽的影响都不显著，但2,4-D的影响比BA大。愈伤组织分化不定芽的最佳培养基为：MS+BA0.5mg／L+2,4-D 0.1mg／L+蔗糖30g／L+琼脂6.5g／L，此时不定芽平均分化率为71.1％。叶片直接分化不定芽的最佳培养基为：（1／2N）MS+BA 0.2mg／L+NAA0.02mg／L+蔗糖25g／L+琼脂6.5g／L，此时单个外植体平均产生有效芽3.9个，平均分化率达85％以上。低浓度的KT对杨树组培苗生根具有一定的促进作用，最佳生根培养基为：MS+KT0.05mg／L+NAA0.02mg／L+琼脂6～7g／L+蔗糖30g／L。生根组培苗室内炼苗1～2周，用0.1％ABT生根粉溶液蘸根，用灭菌的园土：山沙（4：1）做基质，生根组培苗移栽成活率可达90％以上。通过几种抗生素对根癌农杆菌菌株LBA4404的抑菌试验和对中嘉8号杨叶片分化不定芽影响的研究，建立了比较有效的中嘉8号杨叶片直接分化芽基因转化受体系统。研究结果表明：噻孢霉素（cef）对农杆菌LBA4404的抑制效果最好，最佳用量为150～200mg／L，此时对农杆菌的校正抑菌率为81.8％～100％，叶片分化不定芽的频率可达73.3％以上。卡那霉素（Km）用量为5～60mg／L时完全抑制愈伤组织和不定芽的发生；Km对芽的伸长生长也有抑制作用，Km=60mg／L时，芽的存活率为0。在筛选转化体时，Km使用浓度对芽苗以30mg／L为宜。生根筛选Km浓度为15mg／L较为合适。链霉素（str）对杨树叶片分化不定芽具有类似生长素的作用效果。用Str10mg／L代替NAA 0.02mg／L与BA配合，不定芽分化率可达71.1％：Str 20 mg／L、NAA 0.02 mg／L与BA0.2 mg／L配合，不定芽分化率高达100％。此外，一定浓度的链霉素影响叶片出芽的部位，在含有链霉素的培养基上，部分叶片在叶柄处分化不定芽，或叶柄叶缘同时分化不定芽，而对照不定芽仅从叶缘发生。研究了影响根癌农杆菌介导BtCry1A基因导入中嘉8号杨的若干因子，建立了中嘉8号杨简单、有效的遗传转化系统。最优转化条件为：预培养12h、菌液(OD600=0.3～0.4)浸染外植体10～15min、共培养4d、共培养培养基中附加乙酰丁香酮（AS）150μmol／L及共培养后延迟10d选择，此时Kmr芽平均诱导率最高达到28.9％。本试验讨论的所有影响转化的因子中，选择时间的影响最大，其次是共培养时间。在转化策略上，采用先再生后选择的方式筛选转化体，尽管假转化体多，后期淘汰率高，纯合难度大，但可以克服由于低浓度Km抑制中嘉8号杨叶片诱导愈伤组织和不定芽分化导致转化难以完成的问题。本研究共转化外植体1936个，分化出Kmr芽外植体171个，Kmr芽平均诱导率为8.8％。经不定芽生长及诱导生根阶段卡那霉素连续筛选，获得了17株Kmr植株，平均转化率为0.88％。对中嘉8号杨转BtCry1A基因植株进行了分子检测和抗虫性鉴定。通过分子检测，从17株中嘉8号杨Kmr植株中，共筛选得到转BtCry1A基因的PCR阳性植株6株，占35.3％；酶联免疫测试和SDS-PAGE电泳结果表明BtCry1A基因在PCR阳性植株6个株系中都有表达，Bt毒蛋白含量幅度为3.88～2.36ppb，平均为3.32ppb。检测结果表明，BtCry1A基因已已整合到中嘉8号杨基因组中并得到表达。MTF法测定结果表明，经中嘉8号杨PCR阳性植株蛋白质处理的粉纹夜蛾细胞死亡率较高，所产生的病理变化与Bt毒素蛋白处理粉纹夜蛾细胞的病变类似，证明BtCry1A基因在转基因植株中得到表达，转基因植株对昆虫离体细胞具有毒杀作用。室内抗虫试验结果表明，饲虫第8天，参试的3个转基因株系对杨扇舟蛾幼虫生长的抑制率分别为66.13％、60.94％和46.65％；虫饲第10天，3个转基因株系的幼虫相对死亡率分别为75.99％、36％和55.99％，此时，对照未转基因植株叶片饲喂的存活幼虫全部化蛹，而3个测试株系叶片饲喂的存活幼虫化蛹率分别为33.3％、18.8％、54.5％，且未化蛹的存活幼虫行动迟缓，体型较小，至饲虫第12天仍不能化蛹。室外栽种的PCR阳性植株也表现出了较明显的抗虫性。虫测结果表明，3个PCR阳性株系对杨扇舟蛾幼虫的生长发育都有明显的抑制作用，其中株系X1效果最好。杨扇舟蛾幼虫取食中嘉8号杨转BtCry1A基因植株叶片后，其中肠上皮细胞出现的病理变化具有典型的Bt晶体毒素作用于鳞翅目昆虫的病理学特征。因此，本研究获得的中嘉8号杨转BtCry1A基因植株为抗虫植株，有进一步测试及推广价值。