论文摘要
目的慢性粒细胞白血病（CML）是一种起源于多能造血干/祖细胞恶性增殖性疾病,在我国发病率约0.36/10万,占各类白血病的20%。目前治疗方法主要以干扰素、骨髓移植、酪氨酸激酶抑制剂为主,但存在费用昂贵、骨髓来源受限、疗效不理想、耐药性等问题。从祖国医学宝库中寻找出既能抑制白血病细胞恶性增殖,副作用相对较小的天然药物已成为治疗白血病的重要途径。青蒿素是传统中药分离提取的含特殊过氧基团的倍半萜类化合物,它是被世界卫生组织认定为治疗恶性疟疾唯一有效药物,也是我国医学领域中为数不多的被国际认可的一类新药。近年研究证明:青蒿素的衍生物有150多种,人们仅对其中几种衍生物的抗肿瘤作用进行了研究,但这些衍生物大多属于脂溶性或醇溶性药物,在实际应用中带来诸多不变,并且大大影响其用药效果。据此,课题组从青蒿中提取到一种水溶性成分,观察它对人慢性髓系白血病细胞株K562、人脐血单个核细胞和移植性人白血病模型小鼠的药理作用,探讨其作用机理,为寻找出具有抗癌活性而毒副作用低的水溶性青蒿素衍生物提供理论与实验依据。方法1.采用MTT比色法检测青蒿水提物对K562细胞增殖抑制的作用;光、电镜下观察青蒿水提物作用后的K562细胞形态学变化特征;流式细胞术AnnexinV-FITC加碘化丙啶（PI）双染定量检测在不同浓度、不同时间作用下青蒿水提物诱导K562细胞和正常人脐血单个核细胞的细胞凋亡率和胀亡率。2.采用荧光分光光度计检测青蒿水提物作用下的K562细胞膜流动性变化;激光扫描共聚焦显微镜技术检测青蒿水提物作用下的K562细胞内游离[Ca2+]变化,细胞线粒体膜电位变化。3.采用尾静脉移植K562细胞的方法在SCID小鼠建立白血病模型。在成功建立人类移植性白血病模型的基础上,给予模型小鼠腹腔注射青蒿水提物的治疗。通过比较发病情况、生存期、外周血象和骨髓象分析,检测bcr-abl癌基因的表达等方面观察青蒿水提物对荷瘤小鼠的影响。结果1.青蒿水提物对K562细胞有一定的促进分化和明显的增殖抑制作用,24h、48h、72h的半数抑瘤浓度IC50 （μg/ml）分别为65.17、31.63、10.51。青蒿水提物主要引起K562细胞的凋亡和胀亡变化,其凋亡率与胀亡率无明显差别。一定浓度的青蒿水提物对脐血单个核细胞无明显抑制作用。2.青蒿水提物可增加K562细胞膜流动性,有明显量效、时效关系;青蒿水提物可使K562细胞内的游离[Ca2+]升高,并有一定剂量依赖性;当增加细胞外液[Ca2+]浓度后,K562细胞内[Ca2+]增加;在细胞外液中加入钙离子抑制剂以后,胞内[Ca2+]降低。一定浓度的青蒿水提物引起K562细胞线粒体膜电位的下降。3.采用尾静脉移植K562细胞的方法在SCID小鼠建立白血病模型,接种第四周就可在外周血涂片中观察到白血病细胞。在小鼠的肝、脾、肾、外周血、骨髓等检测到人白细胞浸润,部分小鼠有实体瘤生成。4.移植性白血病模型小鼠给予青蒿水提物腹腔注射治疗,小鼠的一般状况较对照组明显改善,体重较对照组降低程度变轻,生存期延长;小鼠的外周血白细胞数明显减少;骨髓象粒细胞中成熟粒细胞比例增加;仅在小鼠外周血检测有bcr-abl表达,骨髓细胞、肝、脾等未检测到bcr-abl表达。结论1.青蒿水提物对体外培养的K562细胞的增殖抑制作用有促进细胞凋亡和胀亡两种方式,且两种方式作用比较无差别。2.≤50μg/ml浓度的青蒿水提物对人脐血单个核细胞无明显抑制作用。3.青蒿水提物对K562细胞的增殖抑制主要作用于细胞膜,可促进细胞膜通透性改变,进一步引起细胞内钙离子浓度增高,线粒体膜电位下降,从而诱发K562细胞凋亡和胀亡。4.通过尾静脉注射K562细胞到SCID小鼠的方法可以成功建立人类移植性白血病模型。5.青蒿水提物对移植性白血病模型鼠有一定的治疗作用。
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