刀豆愈伤组织建立及愈伤组织中刀豆氨酸的形成

论文摘要

刀豆氨酸是一种天然非蛋白氨基酸,和精氨酸的分子结构非常相似,由于其能代替精氨酸被精氨酸tRNA合成酶误认为是精氨酸而合成到蛋白质中,而使含刀豆氨酸的蛋白质生理功能有缺陷,从而有良好的抗肿瘤性。刀豆氨酸是蝶形花亚科（Papilionnoidea）和豆科（leguminosae）植物种子中的可溶性氮的存贮库,它也被认为是一种保护植物不被病虫害等侵染的植物天然性次生代谢产物,这是因为刀豆氨酸对某些害虫表现出一定的毒性作用,由于其具有毒性而被认为是一种潜在的杀虫剂,其优点表现为低毒性,对自然界无污染,从它的作用机制判断,由于它不损害病虫的寄生性天敌,因此具有保护病虫天敌昆虫特性。刀豆氨酸的主要来源是通过人工合成和从植物中提取两种途径。而植物提取中通过组织培养技术可以获得次生代谢产物且一般是成本低,收取率高,对环境污染少,目前国内还未见关于刀豆愈伤组织的报道,本研究主要是利用刀豆种子诱导愈伤组织,以细胞鲜重、干重、细胞相对生长率以及刀豆氨酸含量为考察指标,进行多因素多水平的优化实验,分析液体悬浮培养过程中生理生化指标,且对其中的刀豆氨酸含量进行测定,通过研究拟建立一种新的简便、快速测定刀豆氨酸的方法,研究结果表明:（1）通过研究2,4-二硝基氟苯与刀豆氨酸在pH 9.5硼砂缓冲溶液中反应的最佳条件,建立了一种新的、快速简便的测定刀豆氨酸的方法,即运用了分光光度法测定络合物在571 nm处的吸光度。结果表明:在50℃水浴30 min后,刀豆氨酸与2,4-二硝基氟苯发生显色反应,即形成绿色1:1的稳定络合物。其最大吸收峰在571nm,表观摩尔吸光系数ε= 1.086×104L/（mol·cm）,在13.75220.00μg/mL范围内遵守比尔定律,对应线性回归方程为:y=0.0051x+0.0682;相关系数为:R2=0.9939。加标回收率为96.60101.56%范围之内,相对标准偏差在1.768%之内,从而建立了刀豆氨酸简单、快速测定的新方法。（2）以刀豆种子为材料,诱导刀豆愈伤组织,建立刀豆愈伤组织体系,并进一步培养和增殖,同时,测定了不同颜色愈伤组织中刀豆氨酸含量和不同生长时期愈伤组织中刀豆氨酸含量。结果表明:在MS培养基中可以诱导出浅绿色的刀豆愈伤组织,且在增殖培养基中刀豆愈伤组织的生长特点呈现“S”型曲线模式,生长周期为24d。研究发现在绿色愈伤组织中刀豆氨酸含量最高为43.462μg/gFW（细胞鲜重）,其次是浅绿色的,接着是白色的,含量最少的是褐化的愈伤组织21.626μg/gFW。在愈伤组织组织生长过程中刀豆氨酸含量呈先上升后有所下降趋势。含量最高的时期为培养24d,其刀豆氨酸含量为30.675μg/gFW。（3）运用正交试验设计方法,以鲜重、干重、细胞相对生长率以及刀豆氨酸含量为指标,对刀豆愈伤组织进行多因素多水平进行考察。结果表明:蔗糖对愈伤组织生长的影响最为显著。同时也对刀豆氨酸含量影响显著。如果以愈伤组织生长量为目标:最佳培养基为MS+3.0 mg/L6-BA+0.8 mg/LNAA+40g/L蔗糖+7.8g/L琼脂,最佳培养基条件下愈伤组织相对生长率为0.1016,干重达1.1318g.瓶-1;如果以愈伤组织中刀豆氨酸含量为目标:最佳培养基为MS+3.0 mg/L6-BA+0.2 mg/LNAA+20g/L蔗糖+ 7.8g/L琼脂,最佳培养基条件下刀豆氨酸含量为63.2432μg/L FW和617.5320μg/L DW。（4）挑选质地疏松、生长状态均一、分散性好的刀豆愈伤组织作为接种材料进行悬浮培养,比较分析了悬浮培养过程中各种生理生化指标以及刀豆氨酸含量的变化。实验结果表明:刀豆愈伤组织悬浮培养呈“S”型曲线,生长周期为18d。胞内和胞外可溶性蛋白含量以及细胞活力呈先上升后下降趋势,而培养液中的pH变化和胞外过氧化物酶含量呈先下降再上升趋势;且刀豆氨酸含量先稍有下降然后再上升,最后又下降的趋势,表明培养液的pH值和胞外过氧化物酶活性与刀豆氨酸含量具有相关性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 刀豆的概述
• 1.2 刀豆氨酸的概述
• 1.2.1 刀豆氨酸的发现
• 1.2.2 刀豆氨酸的制备
• 1.2.3 刀豆氨酸的分布
• 1.2.4 刀豆氨酸的功能
• 1.2.5 刀豆氨酸作为潜在杀虫剂的优点
• 1.2.6 刀豆氨酸的测定方法
• 1.2.7 刀豆氨酸合成代谢途径
• 1.3 植物组织培养
• 1.4 问题与展望
• 1.5 本研究的目的和意义
• 2 引言
• 3 材料与方法
• 3.1 试验材料
• 3.2 实验设计与方法
• 3.2.1 一种新的测定刀豆氨酸的方法的研究
• 3.2.2 愈伤组织的诱导和增殖
• 3.2.3 正交实验设计优化刀豆愈伤组织培养基
• 3.2.4 刀豆愈伤组织悬浮培养过程中各生理生化指标的变化
• 3.3 主要仪器和试剂
• 3.3.1 主要仪器
• 3.3.2 主要试剂
• 3.4 数据的处理与分析
• 4 结果与分析
• 4.1 一种新的测定刀豆氨酸方法的研究
• 4.1.1 吸收光谱
• 4.1.2 影响反应因素的优化
• 4.1.3 反应机理的初探
• 4.1.4 标准曲线
• 4.1.5 样品分析
• 4.2 刀豆愈伤组织诱导与增殖培养
• 4.2.1 愈伤组织结构形态观察
• 4.2.2 愈伤组织生长曲线的测定及其刀豆氨酸含量的测定
• 4.3 正交实验法优化刀豆愈伤组织培养基
• 4.3.1 不同培养基中愈伤组织生长情况
• 4.3.2 植物激素对刀豆愈伤组织生长的影响
• 4.3.3 不同激素配比对刀豆氨酸含量的影响
• 4.4 刀豆悬浮细胞生长过程中各生理生化指标的变化
• 4.4.1 刀豆愈伤组织悬浮培养的生长曲线
• 4.4.2 培养液pH 的变化
• 4.4.3 胞外过氧化物酶活力与细胞鲜重之间的关系
• 4.4.4 胞外蛋白浓度与细胞鲜重之间的关系
• 4.4.5 可溶性蛋白含量和细胞鲜重之间的关系
• 4.4.6 悬浮培养过程中细胞活力的变化
• 4.4.7 刀豆氨酸含量与细胞生长之间的关系
• 5 讨论
• 5.1 一种新的测定刀豆氨酸的方法
• 5.2 刀豆愈伤组织的诱导增和殖培养
• 5.3 正交实验设计
• 5.4 悬浮培养
• 6 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 在读研究生期间发表的论文