罗氏海盘车（Asterias rollestoni）水溶性海星皂苷的分离纯化及其部分生物学活性研究

论文摘要

海星皂苷是具有广泛生理和药理活性的天然海洋活性物质。目前,对海星皂苷的提取主要采用稀醇萃取法,这种方法存在着有机溶剂使用量大、成本高、易污染环境、不利于工业化推广等一系列缺点,而且所得海星皂苷水溶性较差,在很大程度上限制了其在临床和农业等领域的应用途径和应用范围。但至今仍未见到有关水溶性海星皂苷的分离纯化及其生物学活性的研究报道。本文旨在利用水抽提法、大孔树脂吸附、硅胶柱层析以及Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱等方法对水溶性海星皂苷进行提取和分离纯化,并从中筛选出具有较强抗真菌和抗肿瘤活性的单体组分。对水抽提物的大孔吸附树脂70%乙醇洗脱组分的性质鉴定结果显示,所得水溶性海星皂苷粗品为甾体皂苷。抗真菌活性鉴定结果表明,水溶性海星皂苷粗品对黑曲霉（Aspergillus niger）、白色念珠菌（Candida albicans）、啤酒酵母菌（Saccharomyes cerevisise）、裂殖酵母菌（Schizosaccharomyces probe）、黄瓜枯萎病原菌（Fusarium oxysporumf.sp.cucumerinum）、葡萄炭疽病原菌（Colletotrichum gloeosporioides）6种真菌均具有显著的抗真菌活性,其最低抑菌浓度（MIC值）分别为0.625、0.625、0.313、0.156、1.25和0.625 mg/mL。抗肿瘤活性的鉴定结果显示,水溶性海星皂苷粗品对体外培养的HeLa宫颈癌细胞、SGC-7901胃癌细胞、A-549肺癌细胞和Bel-7402肝癌细胞均具有显著的抗肿瘤活性,其IC50值分别为14.66、15.37、13.44和12.74 g/mL。对水溶性海星皂苷粗品进行硅胶柱层析,分离纯化得到4种水溶性海星皂苷纯化组分pSF-1、pSF-2、pSF-3和pSF-4。其抗真菌活性的鉴定结果表明,pSF-3和pSF-4具有显著的抗真菌活性。抗肿瘤活性鉴定结果表明pSF-3和pSF-4具有显著的抗肿瘤活性,其中,pSF-3对HeLa宫颈癌细胞、SGC-7901胃癌细胞、A-549肺癌细胞和Bel-7402肝癌细胞的IC50值分别为7.05、5.28、5.32、6.16 g/mL,pSF-4对HeLa宫颈癌细胞、SGC-7901胃癌细胞、A-549肺癌细胞和Bel-7402肝癌细胞的IC50值分别为7.24、5.94、5.24、6.21 g/mL。利用Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱对硅胶柱层析组分进行纯化,得到了SF-3纯化组分。高效液相色谱（HPLC）对其纯度进行测定的结果表明,SF-3组分纯度高达96%以上,已为单体组分。对SF-3单体组分进行体外抗肿瘤活性鉴定结果显示,2.5、5和10μg/mL的SF-3单体组分对体外培养的HeLa和Bel-7402肝癌细胞均具有显著的抑制作用;对SF-3单体组分进行体外抗肿瘤活性的研究结果表明,灌胃剂量为2、5和10 mg/kg体重的SF-3单体组分能够显著抑制小鼠S180实体瘤的生长,其抑制率分别为23.34%、36.33%和46.53%,且10 mg/kg体重的SF-3单体组分能显著提高S180荷瘤小鼠的胸腺指数和脾脏指数。综上所述,本文利用水抽提、大孔树脂吸附、硅胶柱层析以及Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱层析等方法得到了具有显著抗真菌活性和抗肿瘤活性的水溶性海星皂苷纯化组分pSF-3和pSF-4以及具有体内外显著抗肿瘤活性的SF-3单体组分,为利用其研发天然高效抗肿瘤和抗真菌海洋药物奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 文献综述
• 1 皂苷概述
• 2 海星皂苷研究进展
• 2.1 海星皂苷的种类与化学结构
• 2.1.1 多羟基甾体皂苷
• 2.1.2 环式甾体皂苷
• 2.1.3 海星皂苷
• 2.2 海星皂苷的分离提取与纯化工艺方法
• 2.2.1 海星皂苷的分离提取
• 2.2.2 海星皂苷的纯化
• 2.2.3 海星皂苷的理化性质
• 2.3 海星皂苷的生物学活性
• 2.3.1 细胞毒活性
• 2.3.2 抗菌活性
• 2.3.3 抗肿瘤活性
• 2.3.4 溶血活性
• 2.3.5 调节生殖发育
• 2.3.6 降血压作用
• 2.3.7 抗炎活性
• 3 本文的研究目的及研究意义
• 3.1 研究目的
• 3.2 研究意义
• 第二章 水溶性海星皂苷粗品的提取及其抗肿瘤、抗真菌活性研究
• 1 实验材料、试剂与仪器
• 1.1 实验材料
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器设备
• 2 实验方法
• 2.1 水溶性海星皂苷提取
• 2.1.1 AB-8 大孔树脂预处理
• 2.1.2 水溶性海星皂苷粗品提取制备
• 2.1.3 水溶性海星皂苷粗品皂苷性质鉴定实验
• 2.2 水溶性海星皂苷粗品抗真菌活性研究
• 2.2.1 水溶性海星皂苷溶液制备
• 2.2.2 菌悬液制备
• 2.2.3 抑菌环直径测定
• 2.2.4 最低抑菌浓度（MIC）测定
• 2.3 水溶性海星皂苷粗品体外抗肿瘤活性研究
• 2.3.1 无菌水溶性海星皂苷粗品母液制备
• 2.3.2 水溶性海星皂苷粗品体外抗肿瘤作用形态学观察
• 2.3.3 四甲基偶氮唑盐比色法（MTT 法）测定水溶性海星皂苷粗品体外抑癌率
• 3 结果与分析
• 3.1 水溶性海星皂苷粗品皂苷性质鉴定
• 3.2 水溶性海星皂苷粗品抗真菌活性实验
• 3.2.1 抑菌环测定结果
• 3.2.2 供试真菌MIC 值测定
• 3.3 水溶性海星皂苷粗品体外抗肿瘤活性研究
• 3.3.1 体外抗肿瘤细胞形态学观察
• 3.3.2 肿瘤细胞抑制率测定结果
• 4 讨论
• 4.1 水溶性海星皂苷粗品提取
• 4.2 水溶性海星皂苷粗品皂苷性质测定
• 4.3 水溶性海星皂苷抗真菌活性
• 4.4 水溶性海星皂苷体外抗肿瘤活性
• 5 结论
• 第三章 水溶性海星皂苷的分离纯化及其高效抗真菌和抗肿瘤活性组分的筛选
• 1 实验材料、试剂与仪器
• 1.1 实验材料
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器设备
• 1.4 展开剂与显色剂
• 2 实验方法
• 2.1 水溶性海星皂苷硅胶柱层析
• 2.2 硅胶柱层析纯化组分皂苷性质鉴定
• 2.3 水溶性海星皂苷各纯化组分抗真菌活性研究
• 2.3.1 水溶性海星皂苷各纯化组分抑菌环直径测定
• 2.3.2 水溶性海星皂苷各纯化组分的最低抑菌浓度（MIC）测定
• 2.4 水溶性海星皂苷各纯化组分体外抗肿瘤活性研究
• 2.5 水溶性海星皂苷硅胶柱纯化组分Sephadex LH-20 葡聚糖凝胶柱层析
• 2.6 水溶性海星皂苷纯化单体组分纯度鉴定
• 2.7 实验数据统计学处理
• 3 结果与分析
• 3.1 水溶性海星皂苷粗品硅胶柱层析结果
• 3.2 水溶性海星皂苷各纯化组分皂苷性质鉴定结果
• 3.3 水溶性海星皂苷各纯化组分抗真菌活性研究结果
• 3.3.1 水溶性海星皂苷各纯化组分抑菌环直径测定结果
• 3.3.2 水溶性海星皂苷各纯化组分对供试真菌的MIC 值测定结果
• 3.4 水溶性海星皂苷各纯化组分抗肿瘤活性筛选结果
• 3.5 水溶性海星皂苷纯化组分Sephadex LH-20 葡聚糖凝胶柱层析
• 3.6 水溶性海星皂苷SF-3 单体组分高效液相图谱
• 4 讨论
• 4.1 水溶性海星皂苷粗品的分离纯化
• 4.2 硅胶板薄层层析（TLC）
• 4.3 水溶性海星皂苷各纯化组分抗真菌活性筛选
• 4.4 水溶性海星皂苷各纯化组分体外抗肿瘤活性筛选
• 4.5 水溶性海星皂苷纯化组分Sephadex LH-20 葡聚糖凝胶柱层析
• 4.6 水溶性海星皂苷单体组分高效液相层析
• 5 结论
• 第四章 水溶性海星皂苷单体组分 SF-3 抗肿瘤活性研究
• 1 实验材料、试剂与仪器
• 1.1 实验材料
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器
• 2 实验方法
• 2.1 水溶性海星皂苷单体组分SF-3 皂苷性质鉴定
• 2.2 水溶性海星皂苷单体组分SF-3 体外抗肿瘤活性研究
• 2.2.1 水溶性海星皂苷单体组分SF-3 体外抑制肿瘤细胞的形态学观察
• 2.2.2 水溶性海星皂苷单体组分SF-3 体外抑瘤率研究
• 2.3 水溶性海星皂苷单体组分SF-3 体内抗肿瘤活性研究
• 180 移植瘤模型建立'>2.3.1 小鼠S₁₈₀移植瘤模型建立
• 180 移植瘤的抑制作用'>2.3.2 SF-3 单体组分对小鼠S₁₈₀移植瘤的抑制作用
• 2.3.3 对荷瘤小鼠免疫器官的影响
• 2.3.4 数据处理
• 3 结果与分析
• 3.1 水溶性海星皂苷单体组分SF-3 皂苷性质鉴定结果
• 3.2 水溶性海星皂苷单体组分SF-3 体外抗肿瘤活性
• 3.2.1 水溶性海星皂苷单体组分SF-3 体外抗肿瘤活性的形态学观察
• 3.2.2 水溶性海星皂苷单体组分SF-3 对体外培养的肿瘤细胞的抑制率
• 3.3 水溶性海星皂苷单体组分SF-3 体内抗肿瘤作用
• 180 实体瘤的抑制'>3.3.1 SF-3 对小鼠S₁₈₀实体瘤的抑制
• 3.3.2 SF-3 对小鼠免疫器官的影响
• 4 讨论
• 4.1 水溶性海星皂苷单体组分SF-3 体外抗肿瘤作用
• 4.2 水溶性海星皂苷单体组分SF-3 体内抗肿瘤作用
• 4.2.1 SF-3 体内抗肿瘤作用
• 4.2.2 SF-3 对小鼠免疫指数的影响
• 5 结论
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历
• 硕士期间发表文章