论文摘要
聚-β-羟基丁酸酯（PHB）是由多种革兰氏阳性和阴性菌作为菌体内含物所生成的一种结构简单的大分子聚合物,通常是在细菌非平衡生长时体内碳源和能源的储藏物质,其最典型特征是具有生物降解性和生物相容性。在“白色污染”日益严重的今天,以 PHB 代替传统通用塑料已引起普遍关注。 本实验利用高效降解 PHB 的菌株,分离纯化其胞外解聚酶,进行酶学和蛋白质学研究,主要结果如下: 1、以青霉（Penicillium sp.）DS9701-09a 菌株为出发菌株,测定其每日酶活值,产酶高峰为 96 小时。发酵液经过离心、超滤浓缩、硫酸铵沉淀、层析纯化后,得 PHB 解聚酶,纯化倍数为 37.9,回收率 11.81%。分别利用 SDS-PAGE 电泳,高效液相色谱和生物质谱鉴定酶蛋白。 2、酶蛋白的基本性质:质谱显示该蛋白的相对分子质量约为 44.8KD,双向电泳检测等电点为 6.7,双倒数作图法求出酶动力学 Km 值为 0.128 mg/ml。该酶最适反应温度和反应 pH 值分别为 50℃和 5.0,化学试剂 EDTA、SDS 和巯基乙醇强烈抑制酶活性,而 H2O2和尿素对酶活性的抑制作用不大。 3、经过 110℃ HCl 水解蛋白质,Agilent Zorbax C18 色谱柱测定氨基酸组成,含有 16 种常规氨基酸,对色氨酸未进行检测。蛋白电泳样品以 3-（环己氨基）-1-丙磺酸（CAPS）为缓冲液转聚偏氟乙烯（PVDF）膜后,依据 Edman 降解原理应用 ABI 491A 型氨基酸测序仪测定蛋白质 N 末端序列,第一个氨基酸可能是丙氨酸（Ala）或天冬酰胺（Asn）,第二个可能是苏氨酸（Thr）或缬氨酸（Val）,第三个可能是苏氨酸（Thr）。 4、应用 CD 光谱检测蛋白质的二级结构,当溶液中不含（NH4）2SO4时,α-螺旋和β-转角分别占 65.80%和 34.20%;当溶液中含有（NH4）2SO4盐时,α-螺旋、β-转角和任意卷曲分别占 7.90%、29.30%和 62.80%。
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