鼠疫耶尔森氏菌F1-V基因克隆、表达、蛋白质纯化以及免疫保护性的初步研究

论文摘要

鼠疫（plague）是由鼠疫杆菌（Yersinice pestis）引起的严重的动物疫源性传染病,主要通过蚤类媒介传播在啮齿动物间引起原发性流行。人被疫蚤叮咬后可发生腺鼠疫,鼠疫败血症可继发肺鼠疫,肺鼠疫可通过飞沫传染引起人传人流行。在无特效药以前,肺鼠疫患者几乎全部死亡,未进行预防接种的腺鼠疫的死亡率亦高达40-80%。近年来,全世界每年都有几千例病例报告。因此,2000年世界卫生组织将鼠疫列为重新抬头的传染病。1994年印度古吉拉特邦苏拉特市爆发鼠疫流行表明,即使是在现代公共卫生条件下,鼠疫仍有可能侵入大城市,造成严重的暴发流行。此外,鼠疫耶尔森氏菌还是传统的重要生物战剂,是国际恐怖分子可能用于制造生物恐怖的首选微生物之一。长期以来人们一直致力于鼠疫疫苗的研发,以防治这种自古以来就令人生畏的传染病。 当今世界曾经应用于人体免疫的鼠疫疫苗大体上可分为死疫苗和活疫苗两大类。最初的鼠疫死菌苗出自鼠疫正在肆虐的印度（1897）,而在越南战争（1961～1971）中得到较为广泛的应用的鼠疫死菌苗为美军的USP疫苗。但近期的动物学研究表明,死菌苗对肺鼠疫的保护效果较差。鼠疫减毒活疫苗出现于1908年,在20世纪下半叶减毒的EV76活菌苗在许多国家得到广为使用。但由于EV76不是无毒株,在使用安全方面存在许多隐患,因此许多国家已不再使用。到目前为止,尚无足够研究数据可以评价任何一种鼠疫疫苗的有效性和安全性,而且上述疫苗还伴有严重的副作用。所以发展一种安全、有效的鼠疫疫苗是当务之急。目前,鼠疫疫苗的研发工作主要集中在新型减毒活疫苗株的选育和重组基因工程亚单位疫苗的研制上。 近年来研究证明,鼠疫耶尔森氏菌免疫保性抗原主要决定两种成分:一是鼠疫菌的荚膜的蛋白抗原（Fraction F1）,由65mD质粒决定,编码分子量约为15.5kD的多肽,F1分子具有毒性弱而抗原性强,并含有多个抗原决定簇,在体内具有抗细胞吞噬作用,可诱导机体产生荚膜抗体,并与鼠疫菌感染的抵抗力密切相关;另一个是鼠疫菌表面抗原（V）分子,由45mD质粒决定,编码分子量约37kD的多肽,V抗原同样具有毒性弱而抗原性强,并含有多个抗原决定簇,它除有抗吞噬能力外,还能促进鼠疫菌在单核细胞内繁殖。由于F1和V是鼠疫重要的保护性抗原和在属间的保守性,以及F1-V融合抗原分子在免疫原性和免疫保护上具有叠加效应,已成为鼠疫新型疫苗研制的首选保护性抗原分子。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 鼠疫杆菌生物学特性
• 1.2 传统鼠疫疫苗的发展
• 1.2.1 死疫苗的研究
• 1.2.2 EV76减毒活疫苗的研究
• 1.3 鼠疫菌有效抗原分析
• 1.4 鼠疫重组亚基疫苗的研究
• 1.4.1 F1抗原和V抗原重组蛋白的保护作用
• 1.4.2 F1-V融合蛋白抗原对鼠疫的保护作用
• 1.4.3 F1抗原和V抗原的DNA疫苗的保护作用
• 1.5 展望
• 第二章 引言
• 第三章 鼠疫耶尔森氏菌F1-V基因的克隆及原核表达
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 实验结果
• 3.2.1 鼠疫耶尔森氏菌F1基因及V基因的PCR扩增及克隆
• 3.2.2 F1基因和V基因序列测定
• 3.2.3 F1-V／pET-11c重组表达质粒的构建
• 3.2.4 F1-V融合蛋白的诱导表达
• 3.2.5 F1-V融合蛋白Western-Blot鉴定
• 第四章 鼠疫耶尔森氏菌F1-V融合蛋白的纯化
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 实验结果
• 4.2.1 纯化F1／pET-28a
• 4.2.2 纯化V／pET-32a
• 4.2.3 纯化F1-V／pET-11c
• 3凝胶佐剂包裹F1-V融合蛋白疫苗免疫原性研究'>第五章 Al（OH）₃凝胶佐剂包裹F1-V融合蛋白疫苗免疫原性研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 方法
• 5.2 实验结果
• 3凝胶佐剂包裹的鼠疫耶尔森氏菌蛋白疫苗的鉴定'>5.2.1 Al（OH）₃凝胶佐剂包裹的鼠疫耶尔森氏菌蛋白疫苗的鉴定
• 5.2.2 免疫后血清中特异性抗体变化情况
• 5.2.3 T淋巴细胞亚群分析
• 5.2.4 T淋巴细胞增殖实验
• 5.2.5 F1-V融合蛋白抗原免疫BALB／c小鼠效力试验
• 第六章 PLGA微球包裹F1-V融合蛋白疫苗免疫原性研究
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.2 方法
• 6.2 实验结果
• 6.2.1 微球的形态观察、粒径大小及分布测定
• 6.2.2 微球中蛋白含量测定
• 6.2.3 鼠疫疫苗微球的体外释放试验
• 6.2.4 滴鼻免疫后血清和鼻粘膜中特异性抗体变化
• 6.2.5 T淋巴细胞亚群分析
• 6.2.6 T淋巴细胞增殖实验
• 第七章 结论与讨论
• 7.1 结论
• 7.2 讨论
• 参考文献
• 缩略词表
• 致谢
• 在学期间发表的文章