基因点突变检测新方法及新型界面设计的免疫传感器研究

论文摘要

人类的许多遗传性疾病都是由于基因的变异引起的,其中尤以单碱基的突变,即单碱基多态性最为普遍。实现对这些基因单碱基突变的早期、准确、简便、快速的确认,对于人类相关疾病的发病机理研究及早期治疗具有非常重要的意义。目前,有关单碱基突变的检测方法已有许多报道。而这些传统的方法普遍操作繁琐费时、不易定量、仪器昂贵、且对工作人员要求较高的专业技能,因此仅能在少数实验室应用。开发一些简便、价廉、精确且易于临床推广的方法是一件很有价值的工作。此外,由于电化学生物传感器具有制造简单、灵敏度高、价格低廉而被广泛研究、并已在生物检测中逐步得到了应用。然而,有效的生物活性组分的固定方法是构建性能优良生物传感器的关键,如何将生物活性组分有效地固定在电极表面的固定化方法,以及传感器的重现性和重复使用性等方面存在的问题,严重阻碍了生物传感器的进一步发展和应用。基于当前基因单碱基突变检测技术和生物传感技术敏感膜构建中存在的问题,本研究论文发展了一系列新的基因单碱基突变检测技术及新型界面设计的生物传感器,实现了对目标物的高灵敏测定。主要内容如下:（1）利用核酸标记金纳米颗粒凝集变色的光学特性,提出了一种基于DNA连接酶反应和纳米金聚集特性的比色检测方法,用于单碱基突变的检测（第2章）。通过将高忠实性DNA连接酶的等位特异连接特性与纳米金聚集体系相结合,发展了一种简便且不需要精确温度控制的比色检测方法,可以用于单碱基突变的直接检测。此外,连接反应能在较高的温度下进行,因而减少了因非相关链与探针标记纳米金的非特异作用而引起的背景干扰。该方法可以分为三步来完成:首先是杂交反应,使两个金标探针与DNA目标链杂交形成双链结构;随后的连接反应中,使完全匹配的连接、错配的不连接;最后由热处理步骤来分析探针的连接情况。当加热反应混合液,使形成的DNA双链熔链时,对于完全匹配的情况,溶液的颜色不会恢复到红色。而对于错配的情况,由于聚集金纳米颗粒的重新解离,溶液的颜色又回复到红色。我们用该方法对结肠癌k-ras基因的第12位密码子的突变情况进行了检测,使突变型和野生型得到了很好的区分。此后,我们又将这一检测体系发展用于同种溶液中多目标链的同时检测（第3章）。简言之,长链DNA标记的纳米金在较高的温度下首先发生杂交反应,接着在较低的温度下,金标的短链DNA发生杂交反应。然后,在连接反应中,完全匹配的进行连接,而有错配的不能发生连接。最后,逐步升温进行分析,当温度达到某一形成的双链的熔链温度时,对于完全匹配的情况,溶液的紫外光谱无改变。而对于有错配的情况,由于纳米金聚集体的解离,溶液的光谱发生改变。使用该方法,对β地中海贫血基

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 单碱基多态性
• 1.1.1 单碱基多态性的概念及检测意义
• 1.1.2 单碱基突变的检测方法
• 1.2 电化学免疫传感器
• 1.2.1 电化学免疫传感器及其分类
• 1.2.2 电化学免疫传感界面的构建方法
• 1.3 压电免疫传感器
• 1.3.1 压电免疫传感器的原理
• 1.3.2 压电免疫传感界面的构建方法
• 1.4 本研究论文的构想
• 第2章 纳米金凝集变色效应结合高忠实性DNA 连接酶用于单碱基突变检测
• 2.1 前言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 试剂和仪器
• 2.2.2 核酸链纳米金的修饰
• 2.2.3 点突变的检测
• 2.2.4 细胞中基因DNA 的提取
• 2.2.5 基因DNA 的PCR 扩增
• 2.3 结果和讨论
• 2.3.1 核酸标记金纳米颗粒的制备及特性
• 2.3.2 野生型或突变型目标链与金标DNA 探针的杂交反应
• 2.3.3 熔链分析
• 2.3.4 探针设计
• 2.3.5 金标探针进行野生型或突变型目标链的连接分析
• 2.3.6 基因DNA 的分析
• 2.4 小结
• 第3章 DNA 连接酶介导的纳米金凝集反应用于多目标链单碱基突变的同时检测
• 3.1 前言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 试剂和仪器
• 3.2.2 溶液中多组分的同时测定
• 3.3 结果和讨论
• 3.3.1 探针设计
• 3.3.2 熔链分析
• 3.3.3 影响连接反应的因素
• 3.3.4 金标DNA 探针对野生型或突变型目标链进行连接检测
• 3.4 小结
• 第4章 基于等温滚环扩增反应和纳米金凝集变色的DNA 单碱基突变检测
• 4.1 前言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 试剂和仪器
• 4.2.2 金标核酸探针的制备
• 4.2.3 探针的酶连反应
• 4.2.4 滚环扩增反应的检测
• 4.3 结果和讨论
• 4.3.1 环形探针的设计
• 4.3.2 成环反应温度的选择
• 4.3.3 单碱基突变的检测
• 4.4 小结
• 第5章 分子信标变构控制的电化学通道用于单碱基错配DNA 目标链的无试剂检测
• 5.1 前言
• 5.2 实验部分
• 5.2.1 试剂和仪器
• 5.2.2 电极的预处理和分子信标的固定
• 5.2.3 电极表面分子信标的固定密度
• 5.2.4 分子信标稳定性的考察
• 5.2.5 分子信标环状部分与目标链杂交双链的熔链温度的考察
• 5.2.6 目标链的检测
• 5.2.7 传感器的再生
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 分子信标环状部分与目标链杂交双链的熔链温度的考察
• 5.3.2 分子信标稳定性的考察
• 5.3.3 传感器的电化学响应特性
• 5.3.4 碱基不匹配目标链的区分
• 5.3.5 目标链的检测
• 5.3.6 传感器的再生
• 5.4 小结
• 第6章 Aptamer Beacon 变构控制的电化学通道用于凝血酶的无试剂检测
• 6.1 前言
• 6.2 实验部分
• 6.2.1 试剂和仪器
• 6.2.2 电极的预处理和分子信标识体的固定
• 6.2.3 凝血酶的检测
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 分子信标识体修饰电极的电化学特性
• 6.3.2 凝血酶的检测
• 6.3.3 传感器的再生
• 6.4 小结
• 第7章 基于等离子体聚合膜的电容型免疫传感器
• 7.1 前言
• 7.2 实验部分
• 7.2.1 试剂和仪器
• 7.2.2 传感器的制备
• 7.2.3 实验方法
• 7.3 结果和讨论
• 7.3.1 等离子体聚合膜的特性
• 7.3.2 电容测量中激励频率的优化
• 7.3.3 传感界面的循环伏安特性
• 7.3.4 抗体培育浓度的选择
• 7.3.5 非特异性吸附试验
• 7.3.6 传感器的响应特性
• 7.3.7 传感器的再生
• 7.3.8 人血清样品的分析
• 7.4 小结
• 第8章 基于1,6-己二硫醇和纳米金自组装可再生的电容型免疫传感器研究
• 8.1 前言
• 8.2 实验部分
• 8.2.1 试剂和仪器
• 8.2.2 胶体金的制备
• 8.2.3 传感界面的构建
• 8.2.4 免疫反应的检测
• 8.3 结果和讨论
• 8.3.1 原理
• 8.3.2 电极表面的绝缘性
• 8.3.3 pH 和离子强度对绝缘层稳定性的影响
• 8.3.4 抗体的固定化条件
• 8.3.5 非特异性吸附和回收率实验
• 8.3.6 传感器的响应特性
• 8.3.7 免疫传感器的再生
• 8.4 小结
• 第9章 酶催化沉积放大的电化学阻抗法用于人IgM 的免疫检测
• 9.1 前言
• 9.2 实验部分
• 9.2.1 试剂和仪器
• 9.2.2 金电极的预处理
• 9.2.3 免疫反应及酶标抗体在电极表面的固定
• 9.2.4 酶催化沉积反应
• 9.3 结果与讨论
• 9.3.1 电极界面的电化学阻抗特性
• 9.3.2 蛋白A 浓度的影响
• 9.3.3 抗体包被过程中酸度、稀释度的影响
• 9.3.4 酶标抗体用量的优化
• 9.3.5 pH 和反应时间对酶催化氧化沉积的影响
• 9.3.6 IgM 的测定
• 9.4 小结
• 第10章 纳米金聚集复合物放大的计时电位法测定补体C3
• 10.1 前言
• 10.2 实验部分
• 10.2.1 试剂和仪器
• 3 和金标兔抗羊IgG 的制备及免疫复合物的形成'>10.2.2 金标羊抗人C₃ 和金标兔抗羊IgG 的制备及免疫复合物的形成
• 10.2.3 金电极的预处理
• 10.2.4 抗体及免疫复合物的固定
• 10.2.5 测定方法
• 10.3 结果与讨论
• 10.3.1 免疫传感器的计时电位特征
• 10.3.2 抗体包被条件的优化
• 3 与金标兔抗羊IgG 的配比对电极响应的影响'>10.3.3 金标羊抗人C₃ 与金标兔抗羊IgG 的配比对电极响应的影响
• 3 的测定'>10.3.4 补体C₃的测定
• 10.3.5 传感器的再生
• 10.4 小结
• 第11章 基于邻苯二胺电聚合膜和PSS 聚电解质自组装界面的压电免疫传感器
• 11.1 前言
• 11.2 实验部分
• 11.2.1 试剂和仪器
• 11.2.2 电聚合膜的制备
• 11.2.3 聚电解质自组装及抗体包被
• 11.2.4 共价交联法抗体固定
• 11.2.5 测量方法
• 11.2.6 传感器的再生
• 11.3 结果与讨论
• 11.3.1 电聚合邻苯二胺膜
• 11.3.2 PSS 自组装和IgG Ab 固定
• 11.3.3 酸度对免疫反应的影响
• 11.3.4 传感器的响应特性
• 11.4 小结
• 第12章 基于磁性纳米颗粒固定的压电免疫传感器的研究
• 12.1 前言
• 12.2 实验部分
• 12.2.1 仪器与试剂
• 12.2.2 压电传感器的制备
• 12.2.3 氨基化核壳磁性纳米颗粒的合成
• 12.2.4 核壳磁性纳米颗粒的抗体修饰及在压电晶振表面的固定
• 12.2.5 检测过程
• 12.2.6 传感器再生
• 12.3 结果与讨论
• 12.3.1 磁场的作用
• 12.3.2 晶振表面生物磁性颗粒固定量的估算
• 12.3.3 非特异性吸附的消除
• 12.3.5 传感器的再生
• 12.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录 A 攻读学位期间发表的学术论文目录
• 致谢