植物基因安全转化体系关键技术的研究

论文题目: 植物基因安全转化体系关键技术的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 遗传学

作者: 袁媛

导师: 王涛

关键词: 诱导型,基因删除系统,转基因烟草

文献来源: 中国农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 转基因植物安全性问题一直是各界关注的问题,本研究利用分子生物学技术优化改造传统的植物表达载体,以获得无选择标记基因、无目的基因和无目的蛋白的转基因产品,从而减轻转基因植物带来的安全性问题。 利用PCR方法扩增玉米乙酰苯胺类化合物诱导启动子(In5-2启动子),并与GUS基因相连构建植物表达载体,转化烟草获得转基因烟草植株。在不同诱导时间和不同佐剂浓度条件下,对转基因烟草的GUS活性进行分析。结果表明,诱导剂的存在与GUS基因的表达呈正相关,且随着诱导时间的延长和佐剂浓度的增加,GUS活性均呈增长的趋势。利用PCR技术获得6个不同长度的玉米In5-2启动子5′端缺失片段,分别克隆到植物表达载体p1301中构建一系列植物表达载体,转化烟草获得转基因植株。GUS活性定量检测结果显示,玉米In5-2启动子的核心功能区可能位于ATG上游-1520至-1431bp之间。利用DNAMAN软件分析,在-1108至-1079bp和-891至-864bp之间存在着两个茎环结构,推测茎环结合蛋白位点可能位于-1079至-897bp之间,且ATG上游-388至-86bp之间可能存在乙酰苯胺类化合物诱导元件。 构建诱导型Cre/lox基因删除系统,并在转基因烟草中进行验证。即在诱导剂的处理下,烟草愈伤组织中发生重组反应,基因组中的选择标记基因被删除。在该系统中,乙酰苯胺诱导启动子(In5-2)控制Cre基因的表达。对转基因烟草植株进行分子检测的结果表明,不论标记基因是否被删除,目的基因(gus)均整合到烟草基因组中;在48株To代转基因烟草植株中,有45株是无选择标记基因(hpt)的。该系统只有一个载体,克服了双载体重组系统的缺点。 设计了一个“3-free”系统,用于生产无选择标记基因、无目的基因及其蛋白的转基因植物产品。该系统由三部分组成,即R/RS无标记基因转化体系、绿色组织特异性基因表达系统、诱导型Cre/lox基因删除体系。以转Cry1Ac基因烟草为模型对该系统进行了验证。结果显示,选择标记基因在组织培养阶段被删除了;目的基因在除草剂安全剂田间喷施后是可以被删除的,其删除效率为20%;且由于目的基因的删除,目的蛋白在转基因烟草的叶和根中逐渐降解;在种子中没有检测到目的蛋白。该系统为解决转基因植物生物安全性问题提供了一个新的方向。 利用PCR方法克隆了苏云金芽孢杆菌毒蛋白水解酶基因(nprA),并根据植物密码子偏好性对其进行改造,进行全基因人工合成,命名为mnprA基因。分别将两个基因连入植物表达载体p1301构建植物表达载体,并转化Cry1AC转基因烟草,希望nprA(或mnprA)基因的表达产物在转基因烟草中能将Cry1Ac蛋白水解。然而,我们没有能够得到突变植株,说明nprA基因可能是一个非专一性水解酶基因。

论文目录:

中文摘要

Abstract

缩略词

第一章 文献综述

1.植物转基因技术发展概况

2.转基因植物安全性评价研究进展

3.植物安全转化技术的研究进展

4.本论文的研究意义

第二章 材料与方法

第三章 玉米乙酰苯胺类化合物诱导启动子(In5-2)的克隆及功能验证

1.PCR方法扩增玉米In5-2启动子

2.PCR扩增玉米In5-2启动子缺失片段

3.植物表达载体的构建

4.农杆菌转化烟草和后代植株的分子检测

5.玉米In5-2启动子化学诱导条件的研究

6.玉米In5-2启动子功能区域结构分析

第四章 用于删除选择标记基因的Cre／lox系统

1.植物表达载体的构建

2.删除反应的基本策略

3.烟草转化与化学诱导

4.转基因烟草后代植株的分子检测

第五章 无选择标记基因、无目的基因植物转化体系的研究

1.PCR扩增rbcS启动子

2.植物表达载体pBC的构建

3.农杆菌共转化烟草

4.转基因烟草后代植株的分子检测

5.转基因烟草的田间诱导及分子检测

6.对诱导后的转基因烟草进行ELISA分析

7.抗虫性试验

第六章 利用Bt蛋白酶水解转基因植物中的Cry1Ac蛋白

1.植物密码子偏好性改造nprA基因

2.原核表达载体pET-mnprA的构建

3.nprA蛋白在E.coli中的表达

4.晚期发育阶段启动子(SAG)启动子的克隆

5.植物表达载体的构建

6.烟草转化

第七章 结论与讨论

参考文献

致谢

附录

发布时间: 2005-07-18

参考文献

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• [3].干旱环境胁迫下的植物分子适应机理及其应用研究[D]. 樊正球.复旦大学2004
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• [5].香鳞毛蕨中黄酮代谢途径关键酶基因的克隆与功能验证[D]. 孙莉莉.东北农业大学2015
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