农杆菌介导苹果PPO基因dsRNAi转化‘丰水’梨的研究

论文摘要

砂梨果实在加工和切割的过程中普遍存在的褐变问题,给广大果农和果商带来巨大的经济损失。虽然通过多种手段获得了比较满意的抑制褐变的效果,但是随之带来的负面效果也很多。培育抗褐变的品种是解决这一问题的根本途径之一。在已建立‘丰水’叶片不定芽再生体系的基础上,我们以‘丰水’梨为材料,以苹果多酚氧化酶双链RNA为目的基因,通过农杆菌介导方法转化‘丰水’梨,以期获得抗褐变的转基因砂梨。实验内容和研究结果如下:1、我们研究继代培养基对本实验室保存的‘丰水’梨组培苗生长发育的影响;再以不同继代培养基上培养的叶片为材料,研究叶片生理状态以及氨苄青霉素（Amp）、羧苄青霉素（Carb）、头孢霉素（Cef）和卡那霉素（Km）4种抗生素对不定芽再生的影响。结果表明,以AS为基本培养基,附加BA 0.5mg/L+NAA0.1 mg/L适合‘丰水’梨继代培养,以该配方继代培养21d～32d的叶片不定芽再生率达92.21%～95.38%。在农杆菌介导的‘丰水’梨遗传转化中,单纯考虑杀菌剂对‘丰水’梨叶片再分化的影响,可使用100～300mg/L的Amp、或100mg/L Carb、或100～300 mg/L的Cef,10mg//L为Km筛选的临界浓度。2、我们以‘丰水’梨组培苗叶片为外植体,通过试验初步确定‘丰水’梨遗传转化体系为:农杆菌菌液浓度OD600=0.4～0.5,以含75μmol/L乙酰丁香酮（AS）的NN69O,pH5.5为悬浮液活化菌株,叶块浸染8min后吸干,置于含75μmol/L乙酰丁香酮（AS）的再生培养基上黑暗共培养4天,综合考虑3种抗生素对叶片再分化的影响和对农杆菌抑制效果,我们认为200mg/L～300 mg/L Amp或Cef是理想的杀菌剂,附加杀菌剂延后培养3d,再转入附加杀菌剂和10mg/LKm的选择培养基上黑暗培养21d,再光照培养至不定芽长出。从转化的2019个外植体中获得了16个不定芽,平均不定芽再生率为0.79%。3、‘丰水’梨组培苗叶片按照第三章的体系进行转化试验,延迟培养时间由3d延长至21d,再转入附加10mg/LKm的选择培养基上光照培养至不定芽长出,抗性芽率为4.91%。对获得的8株Km抗性芽进行GUS组织化学染色,结果显示AG180-2和AG180-4为GUS阳性植株;PCR检测初步证实AG180-1、AG180-2、AG180-3、AG180-4等4个株系基因组中已整合APPO基因dsRNAi;RT-PCR检测,证实株系AG180-2中的APPO基因dsRNAj已在转录水平表达。多酚氧化酶（PPO）活性测定结果表明,株系AG180-2的多酚氧化酶（PPO）活性比对照极显著降低了49.45%。可见,将苹果PPO基因双链RNA导入苹果中和导入梨中的效果有差异,这可能是由于导入了异源的PPO基因,导致双链RNA的干扰效果变差。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 缩略词
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1 梨遗传转化研究进展
• 1.1 梨遗传转化的主要进展
• 1.2 影响梨遗传转化的主要因素
• 1.2.1 受体系统
• 1.2.2 基因型
• 1.2.3 农杆菌的侵染力
• 1.2.4 Vir区基因的活化
• 1.2.5 转化细胞的筛选和检测
• 1.2.6 杀菌剂类型和浓度的选择
• 1.2.7 转化过程中外部环境的控制
• 1.3 展望
• 1.3.1 进一步建立一个稳定、高效的再生和转化体系,扩大品种研究范围
• 1.3.2 积极探索更有效的遗传转化方法
• 1.3.3 加快同经济性状相关的目的基因的分离与克隆
• 1.3.4 加强梨转基因生物安全性问题的评估
• 2 果实褐变的研究进展
• 2.1 果实褐变的分类
• 2.2 酶促褐变发生的条件
• 2.3 多酚氧化酶的研究进展
• 2.3.1 PPO基因的遗传学特征
• 2.3.1.1 多基因家族性
• 2.3.1.2 序列的保守性
• 2.3.1.3 没有内含子
• 2.3.1.4 表达大多经过翻译后的加工过程
• 2.3.1.5 时空表达的特异性
• 2.3.1.6 PPO基因的分子结构
• 2.3.2 植物中PPO酶的有关催化机理和催化理论的提出
• 2.3.2.1 半胱氨酸抑制酶促褐变的机理
• 2.3.2.2 PPO的自杀性抑制理论
• 2.3.2.3 PPO的"动力学协作（kinetic synergism）"机制
• 2.3.3 植物组织中PPO酶活性的影响因素
• 2.4 控制果实酶促褐变的途径
• 2.5 展望
• 3 RNAi的研究进展
• 3.1 RNAi的发现
• 3.2 RNAi可能的作用机制
• 3.2.1 与RNAi作用相关的酶
• 3.2.2 RNAi的作用过程
• 3.2.2.1 转录后基因沉默
• 3.2.2.2 基因组DNA甲基化
• 3.3 RNAi在植物品种改良中的应用
• 3.3.1 RNAi改良植物品质
• 3.3.2 RNAi改良植物花色
• 3.3.3 RNAi改良植物抗病性
• 3.4 展望
• 4 立题依据
• 第二章 叶片生理状态和抗生素对‘丰水'梨组培苗叶片再分化的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 叶片生理状态对‘丰水'梨叶片再生不定芽的影响
• 1.2.1.1 继代培养基对‘丰水'梨组培苗生长发育的影响
• 1.2.1.2 继代培养基对‘丰水'梨叶片再生不定芽的影响
• 1.2.1.3 继代培养天数对‘丰水'梨叶片再生不定芽的影响
• 1.2.2 三种杀菌剂对‘丰水'梨叶片愈伤组织诱导和不定芽再生的影响
• 1.2.3 卡那霉素对‘丰水'梨叶片愈伤组织诱导和不定芽再生的影响
• 1.2.4 培养条件
• 2 结果与分析
• 2.1 ‘丰水'梨继代培养基对组培苗生长发育的影响
• 2.2 继代培养基对‘丰水'梨叶片再生不定芽的影响
• 2.3 继代培养天数对‘丰水'梨叶片再生不定芽的影响
• 2.4 三种杀菌剂对‘丰水'梨叶片愈伤组织诱导和不定芽再生的影响
• 2.5 卡那霉素对‘丰水'梨叶片愈伤组织诱导和不定芽再生的影响
• 3 讨论
• 3.1 叶片生理状态对‘丰水'梨叶片不定芽再生的影响
• 3.2 三种杀菌剂对‘丰水'梨叶片愈伤组织诱导和不定芽再生的影响
• 3.3 卡那霉素对‘丰水'梨叶片愈伤组织诱导和不定芽再生的影响
• 第三章 农杆菌介导的‘丰水'梨遗传转化体系的优化
• 1.材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 供试砂梨品种
• 1.1.2 载体与菌株
• 1.1.3 培养基
• 1.1.4 菌株保存
• 1.2 方法
• 1.2.1 农杆菌的培养、活化
• 1.2.2 三种杀菌剂对农杆菌的影响
• 1.2.3 农杆菌浸染浓度的确定
• 1.2.4 农杆菌浸染时间的确定
• 1.2.5 共培养时间的确定
• 1.2.6 AS的添加方式的确定
• 1.2.7 含AS悬浮液的pH值
• 1.2.8 卡那霉素选择压的确定
• 1.2.9 GUS瞬时染色
• 1.2.10 培养条件
• 2.结果与分析
• 2.1 三种杀菌剂对根癌农杆菌的影响
• 2.2 农杆菌浸染浓度的确定
• 2.3 农杆菌浸染时间的确定
• 2.4 共培养时间的确定
• 2.5 AS的添加方式的确定
• 2.6 含AS悬浮液的pH值的确定
• 2.7 卡那霉素选择压的确定
• 3 讨论
• 3.1 三种杀菌剂对农杆菌的影响
• 3.2 菌液浓度和浸染时间对‘丰水'梨遗传转化的影响
• 3.3 共培养时间对‘丰水'梨遗传转化的影响
• 3.4 乙酰丁香酮的添加方式对‘丰水'梨遗传转化的影响
• 3.5 pH值对‘丰水'梨遗传转化的影响
• 3.6 卡那霉素选择压的确定
• 第四章 ‘丰水'梨转基因植株的获得与检测
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.1.1 转化外植体（见第三章1.1.1）
• 1.1.1.2 检测植株
• 1.1.2 载体与菌株（见第三章1.1.2）
• 1.1.3 培养基
• 1.1.4 菌株保存（见第三章1.1.4）
• 1.1.5 试剂
• 1.1.6 溶液配制
• 1.2 方法
• 1.2.1 农杆菌的培养、活化
• 1.2.2 转化
• 1.2.3 抗性植株的获得
• 1.2.4 GUS组织化学染色
• 1.2.5 PCR检测
• 1.2.5.1 ‘丰水'梨基因组DNA的提取
• 1.2.5.2 PCR扩增目的基因
• 1.2.6 RT-PCR检测
• 1.2.6.1 ‘丰水'梨RNA的提取
• 1.2.6.2 总RNA的完整性及纯度检测
• 1.2.6.3 cDNA合成
• 1.2.6.4 RT-PCR扩增目的基因
• 1.2.7 多酚氧化酶（PPO）活性测定
• 1.2.7.1 酶粗提液的获得
• 1.2.7.2 多酚氧化酶（PPO）活性测定
• 2 结果与分析
• 2.1 ‘丰水'梨转基因植株的获得
• 2.2 GUS组织化学染色
• 2.3 PCR检测
• 2.4 RT-PCR检测
• 2.5 多酚氧化酶（PPO）活性测定
• 3 讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 附录
• 附录1:苹果PPO基因与砂梨PPO基因序列比对
• 附录2:目的基因和载体
• 附录3:图版
• 致谢