淡水水产品中单增李斯特菌双重PCR检测及基因分型

论文摘要

单增李斯特菌（Listeria monocytogenes,LMO）是一种能引起人类脑膜炎、败血症、流产等疾患,可致孕畜流产,几乎可污染所有食品的冷细菌,可在1-4℃条件下生长。上世纪80年代初LMO被列为食源性致病菌,并认为是一种分布十分广泛的食源性致病菌。上世纪90年代LMO又被WHO列为食品四大致病菌之一。我国淡水水生生物资源丰富,冷冻淡水水产品出口量逐年增加。LMO是保证出口冷冻淡水水产品质量安全的必检项目,目前检测LMO的SN0184-93方法需5-14d,mini-VIDAS等仪器检测方法需要特殊试剂且检测成本高。要有效控制LMO污染,除了建立快速、灵敏的检测方法外,更重要的是要对LMO污染的发生、传播和流行规律进行研究。这就需要有一种快速、可重复及分辨率高的分型系统对LMO进行有效的分型。因此,本研究针对单增李斯特菌快速检测方法和基因分型开展了以下工作:1.以hly和iap基因为靶基因设计引物,进而建立了检测淡水水产品中LMO的双重PCR检测方法。2.对建立的方法进行特异性、敏感性和干扰试验。结果表明:该方法具有较高的特异性和敏感性,并能有效排除检测工作中多种常见致病菌的干扰。3.利用本方法对120份冷冻淡水水产品样本进行检测,结果显示其与SN0184-93方法和mini-VIDAS方法的一致性达100%,但比SN0184-93方法快、比mini-VIDAS检测成本低,适合于出入境口岸大样本检验。4.本研究还以LMO 16S-23S rRNA间断序列为目的基因序列,对来自湖北省不同地区,不同水产品样品的LMO分离株间断序列进行研究;以此探讨污染湖北省水产品的LMO菌株间的亲缘关系和追踪水产品中LMO污染途径和路线。5.间断序列分析结果显示:47株LMO分离株可分为3大类,16个基因亚型;碱基突变和插入序列的变化与样本种类和样本地区来源有明显关联。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词
• 第1章 文献综述
• 1.1 单增李斯特菌快速检测方法研究进展
• 1.1.1 传统的分离培养与鉴定方法
• 1.1.2 免疫学检测方法
• 1.1.3 分子生物学检测方法
• 1.1.3.1 核酸探针检测技术
• 1.1.3.2 PCR检测技术
• 1.1.3.2.1 定性PCR技术
• 1.1.3.2.2 巢氏和半巢氏PCR技术
• 1.1.3.2.3 反转录PCR技术
• 1.1.3.2.4 实时定量荧光PCR技术
• 1.1.3.2.5 免疫-PCR检测技术
• 1.2 单增李斯特菌基因分型研究进展
• 1.2.1 LMO传统分型方法
• 1.2.1.1 血清学分型
• 1.2.1.2 噬菌体分型
• 1.2.1.3 多区带酶分型（MEE）
• 1.2.2 LMO分子生物学分型
• 1.2.2.1 RAPD分型
• 1.2.2.2 RFLP分型
• 1.2.2.3 AFLP分型
• 1.2.2.4 SSCP分型
• 1.2.2.5 MLST分型
• 1.2.2.6 PFGE分型
• 1.2.2.7 RT分型
• 1.2.2.8 基因芯片技术
• 第2章 淡水水产品中单增李斯特菌快速检测方法研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 标准菌株
• 2.1.2 分离菌株
• 2.1.3 主要试剂及培养基与缓冲液
• 2.1.3.1 主要试剂
• 2.1.3.2 BP和NB培养基
• 2.1.3.3 琼脂糖凝胶电泳
• 2.1.3.4 其他试剂
• 2.1.4 模板的制备
• 2.1.5 引物设计
• 2.1.6 PCR扩增
• 2.1.7 DNA检测限度实验
• 2.1.8 特异性实验
• 2.1.9 敏感性实验
• 2.1.10 干扰实验
• 2.1.11 与SN0184-93方法和mini-VIDAS方法的比较
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 双重PCR扩增条件的确定
• 2.2.2 不同提取模板方法的扩增结果
• 2.2.3 DNA限度实验结果
• 2.2.4 特异性实验结果
• 2.2.5 敏感性实验结果
• 2.2.6 干扰实验结果
• 2.2.7 与SN0184-93方法和mini-VIDAS方法比较的结果
• 2.3 讨论
• 第3章 湖北省水产品中单增李斯特菌基因分型的研究
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 标准菌株
• 3.1.2 分离株
• 3.1.3 主要生化试剂及培养基与缓冲液
• 3.1.3.1 主要生化试剂
• 3.1.3.2 LB液体和固体培养基
• 3.1.3.3 BP和NB培养基
• 3.1.3.4 质粒提取缓冲液
• 3.1.3.5 琼脂糖凝胶电泳
• 3.1.3.6 其他试剂
• 3.1.4 主要仪器
• 3.1.5 模板提取
• 3.1.6 PCR引物
• 3.1.7 PCR扩增
• 3.1.8 PCR产物鉴定
• 3.1.9 PCR反应特异性试验
• 3.1.10 PCR产物回收
• 3.1.11 回收产物克隆到PMD-18T载体
• 3.1.12 PCR产物测序
• 3.1.13 LMO扩增产物序列分析
• 3.1.14 进化树的构建
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 PCR扩增结果
• 3.2.2 特异性实验结果
• 3.2.3 LMO分离株间断序列315bp片段与566bp片段序列对比分析
• 3.2.4 PCR扩增产物315bp片段分析结果
• 3.2.4.1 突变与插入
• 3.2.4.2 315bp片段序列变化与样品种类的关系
• 3.2.4.3 315bp片段序列变化与样品来源地的关系
• 3.2.5 进化树的构建
• 3.3 讨论
• 第4章 小结
• 4.1 淡水水产品中单增李斯特菌快速检测方法研究
• 4.2 湖北省水产品中单增李斯特菌基因分型的研究
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 课题信息:
• 个人简历:
• 硕士研究生阶段主要研究成果: