西瓜花叶病毒2号基因组序列测定及HC-Pro基因的原核表达

论文摘要

瓜类病毒病害是葫芦科作物上的一类主要病害,病毒种类达30 多种,其中以西瓜花叶病毒2 号（Watermelon mosaic virus 2,WMV-2）的危害最大。WMV-2 发生普遍,并广泛分布于世界各地,通常造成葫芦科作物的大面积减产和品质的下降。本文对我国的WMV-2 基因组分析研究结果如下: 以从病叶中提取WMV-2 的总RNA为模板进行反转录合成互补DNA（cDNA）,设计合成9 对引物,用PCR 方法扩增出WMV-2 全基因组,经序列分析结果表明WMV-2全基因组序列由9657 个核苷酸组成。该基因组有10 个功能基因,包括843bp 的外壳蛋白（CP）基因、1551bp 的核包含体b 蛋白（NIb）基因、729bp 的核包含体a 病毒结合蛋白（NIa-VPg）基因、550bp 的核包含体a 蛋白（NIa-Pro）基因、159bp 的6K2 基因,1902bp 的柱状内含体蛋白（CI）基因、156bp 的6K1 基因、1041bp 的P3 基因、1371bp的辅助成份蛋白（HC-Pro）基因和1329bp 的P1 基因。本研究在国内至整个亚洲都是首次报道。经DNASTAR 软件分析比较,结果显示WMV-2 具有与马铃薯Y 病毒（Potyvirus）属成员的基因组一致的结构特征,具有单一的开放读码框,编码一个由3217 个氨基酸组成的多聚蛋白,相对分子量为365.8kDa。编码的多聚蛋白经自编码的蛋白酶裂解后可形成10 个成熟蛋白,从N-端到C-端分别为P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、NIa-VPg、NIa-Pro、NIb 和CP。各蛋白裂解位点分别是IQHY/S（P1/HC-Pro）、YRVG/G（HC-Pro/P3）、VSAQ/A（P3/6K1）、VKVQ/S（6K1/CI）、VQLQ/S（CI/6K2）、VTTQ/G（6K2/NIa-VPg）、VEVE/S（NIa-VPg/NIa-Pro）、VAVQ/S（NIa-Pro/NIb）、VSLQ/S（NIb/CP）。将我国WMV-2 基因组全序列与法国株系（WMV-Fr）比较,结果表明该病毒与WMV-Fr 核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为92.4% 和96.4%,各编码蛋白区域核苷酸和氨基酸同源性分别为:P1 蛋白分别为91.2%和90.1%,HC-Pro 蛋白分别为94.7%和97.4%,P3 蛋白分别为95.34%和97.1%,CI 蛋白分别为90.5%和95.9%,NIa-Vpg蛋白分别为87.5%和94.7%,NIa-Pro 蛋白分别为89.7%和97.9%,NIb 蛋白分别为92.8%和96.5%,CP 蛋白分别为95.0%和98.6%。与马铃薯Y 病毒属其他成员的全序列进行比较分析,与大豆花叶病毒核苷酸和氨基酸同源性最高,分别为75.1%和86.0%。对WMV-2 的HC-Pro 基因构建了原核表达载体pETWHC,并进行了原核表达,SDS-PAGE 显示表达的HC-Pro 蛋白大小约57kDa。对进一步研究该蛋白功能及非持久性蚜传机制奠定了基础。

论文目录

• 第一章 文献综述
• 1.1 西瓜花叶病毒2 号
• 1.1.1 危害症状及寄主范围
• 1.1.2 株系的划分
• 1.1.3 传播方式
• 1.1.4 理化性质及寄主的组织病理
• 1.1.5 基因组研究
• 1.2 马铃薯Y 病毒属
• 1.2.1 普通生物学
• 1.2.2 传播方式
• 1.2.3 病毒粒子特征
• 1.2.4 病毒粒子侵染寄主的细胞病理学
• 1.2.5 基因组结构与编码蛋白功能
• 1.2.6 国内外研究进展
• 1.3 HC-Pro 蛋白功能
• 1.3.1 蛋白酶活性
• 1.3.2 蚜传活性
• 1.3.3 参与病毒种传过程
• 1.3.4 参与病毒复制及症状表达
• 1.3.5 参与病毒移动
• 1.3.6 调节异源病毒复制及所用机制
• 1.3.7 对寄主植物PTGS 的抑制作用
• 1.4 本研究的目的和意义
• 第二章 试验材料和方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 供试毒源
• 2.1.2 菌种、质粒和试剂
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 WMV-2 RNA 的提取
• 2.2.2 引物设计与合成
• 2.2.3 cDNA 的合成
• 2.2.4 聚合酶链式反应（PCR）
• 2.2.5 目的片段的克隆
• 2.2.6 重组质粒的鉴定
• 2.2.7 目的片段的序列测定和分析
• 2.2.8 WMV-2 HC-pro 基因的原核表达
• 第三章 结果与分析
• 3.1 西瓜花叶病毒2 号的获得
• 3.2 RNA 的提取及检测
• 3.3 WMV-2 基因组各编码蛋白的RT-PCR 扩增
• 3.4 各编码蛋白基因的T-A 克隆
• 3.5 西瓜花叶病毒2 号基因组cDNA 全序列
• 3.6 西瓜花叶病毒2 号基因组结构分析
• 3.7 WMV-2 基因组同源性比较
• 3.8 WMV-2 HC-pro 基因的原核表达
• 3.8.1 原核表达载体的构建
• 3.8.2 WMV-2 HC-pro 基因的原核表达
• 第四章 结论
• 第五章 讨论
• 5.1 RT-PCR 方法的讨论
• 5.2 序列拼接
• 5.4 序列同源性比较
• 5.3 HC-Pro 基因的原核表达
• 5.4 进一步研究的设想
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介