老年膳食营养与骨质疏松关系及黄酮类化合物干预作用的实验研究

论文摘要

骨质疏松（osteoporosis，OP）是一种常见的老年慢性病，它使得骨骼脆性增加，很容易骨折。早期的骨质疏松症没有任何临床症状，如果不进行预防和治疗，骨质疏松症能够渐渐地产生和发展，直到骨折发生。典型的骨折常发生在髋骨，脊柱和腕骨。骨质疏松能够影响任何部位的骨骼，特别容易发生髋骨和脊柱骨折。髋骨骨折患者需要以外科手术主要手段的住院治疗。椎骨骨折也可引起严重的不良后果，包括剧烈的背痛和脊柱畸形。使患者不能自理行走，并且可能导致终生残疾甚至死亡。许多学者采用去势方法复制骨质疏松症动物模型，研究发现模型动物的性激素水平越低，骨矿含量越下降。Cheng SL的研究发现大豆异黄酮有类雌激素的作用，能有效减少骨丢失并增加骨形成。Arjmandi进一步明确提示大豆蛋白中的异黄酮有骨保留作用，指出长期消费大豆或其异黄酮有助于骨质持久。但是关于异黄酮对骨质疏松骨作用机制尚不清楚，有待进一步深入研究，本课题组通过人群膳食调查、骨细胞体外培养和废用性骨质疏松（disuse osteoporosis，DOP）大鼠、去卵巢（ovariectomized，OVX）大鼠模型，探讨老年膳食营养与骨质疏松的关系及大豆异黄酮（soy isoflavone，SIFV）和鸡冠花黄酮类化合物（celosiae cristatae isoflavone，CCFV）对其干预作用。为骨质疏松症的预防、治疗提供理论依据和干预措施。本研究所报道的“鸡冠花提取物对多种大鼠模型骨代谢的影响”及“生长因子在大豆异黄酮预防骨质疏松中的作用”研究，先后经河南省科学技术情报研究所和河南省医学情报研究所查新，得出较高评价结论，认为本研究的许多报道属于国内首次。达到国内领先水平。部分研究论文已被著名的专题文献检索数据库Medline和美国化学文摘收录。第一部分老年人营养与骨密度的关系1．老年人膳食及头发中Zn、Cu、Ca与BMD的关系目的探讨老年人膳食及头发中Zn、Cu、Ca水平与骨密度（bone mineral density，BMD）的关系。方法调查并分析了470例60岁以上城市（205）和农村（256）老人，男性178名，年龄65.70±3.48y，女性292名，年龄65.90±4.02y。检测BMD与发中Zn、Cu、Fe、Ca水平，并进行三日膳食回顾调查。结果城乡老年女性BMD显著低于老年男性，城市老年女性膳食Ca、Zn含量低于城市老年男性，农村老年女性膳食Ca、Zn，发中Zn含量低于农村老年男性（p＜0.05 or p＜0.01）。城乡比较，农村老年男女BMD、膳食Ca，发中Ca、Zn含量低于城市老年男女（p＜0.05 or p＜0.01）。BMD与膳食Ca、Zn、Cu及发中Ca、Zn含量密切相关，膳食Zn与发Ca、Zn以及膳食Ca、Cu存在显著相关（p＜0.05 or p＜0.01）。结论膳食Ca、Zn、Cu与BMD存在一定的关系，膳食Ca、Zn等元素摄入量不足可导致BMD降低。2．部分非循环有向图分析老年人膳食营养素对BMD影响目的用部分非循环有向图分析老年人膳食营养素对骨密度（BMD）影响。方法对309例60岁以上老人进行了膳食调查及健康检查，男性132名，年龄65.4±4.0y，女性177名，年龄66.7±5.8y。并作了膳食营养素对骨密度的多元回归分析，进行了因果研究，绘制出部分非循环有向图（简称p dag）作因果研究。结果老年女性BMD显著低于男性。健康老人平均每日摄入钙、蛋白质的量男性均显著高于女性。OP患者与同性别健康老人每日矿物质摄入量相比，OP组钙、蛋白质（protein）、VitC摄入量均显著低于同性别健康老人组，BMD与钙、蛋白质、VitC均呈显著正相关，与p dag因果分析一致。结论膳食营养素与BMD存在一定的关系，膳食钙、蛋白质、VitC等摄入量不足可导致BMD降低。第二部分大豆异黄酮和鸡冠花黄酮对体外培养新生大鼠成骨细胞增值、分化及部分相关蛋白、基因表达的影响1．鸡冠花黄酮类化合物对成骨细胞矿化和IGF-1的作用目的通过研究鸡冠花黄酮类对成骨细胞体外培养矿化作用和胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor，IGF-1）表达的影响，探讨鸡冠花黄酮类化合物对大鼠成骨细胞的作用机理。方法体外培养新生大鼠颅骨成骨细胞，茜素红染色方法（ARS）研究对成骨细胞矿化的影响，SP免疫组化方法测定成骨细胞中IGF-1的表达情况，用HPIAS-2000图像分析仪对各组表达进行定量分析。结果鸡冠花黄酮类化合物促进大鼠成骨细胞矿化结节形成及IGF-1阳性表达，鸡冠花黄酮类化合物组的IGF-1平均光密度都显著高于对照组（p＜0.05）。结论鸡冠花黄酮类化合物可增强新生大鼠成骨细胞矿化和IGF-1的表达。2．大豆异黄酮对成骨细胞转化生长因子-β1及其受体Ⅰ、Ⅱ表达的影响目的探讨大豆异黄酮对成骨细胞的转化生长因子-β1（transforming growth factor，TGF-β1）信号转导系统的影响。方法制作新生大鼠颅骨成骨细胞体外培养模型，在第三代成骨细胞培养液中添加大豆异黄酮，通过免疫组化方法观察大豆异黄酮对成骨细胞中转化生长因子-β1及其受体Ⅰ、Ⅱ表达的影响。用HPIAS图像分析仪对各组表达进行定量分析。结果免疫组织化学染色显示，大豆异黄酮培养的大鼠第三代成骨细胞中转化生长因子-β1及其受体Ⅰ、Ⅱ呈阳性表达，阳性细胞浆出现棕黄色颗粒。图像分析显示大豆异黄酮组的TGF-β1 TGF-βRI、TGF-βR2平均光密度都显著高于阴性对照组（p＜0.05）。结论在成骨细胞形成中，大豆异黄酮对TGF-β1及其TGF-βR1、TGF-βR2受体的表达有显著促进作用。3．大豆异黄酮和钙对大鼠成骨细胞增殖分化和矿化的作用目的探讨大豆异黄酮和钙对体外培养大鼠颅骨成骨细胞增殖、分化和矿化的作用。方法体外培养新生大鼠颅骨成骨细胞，然后用噻唑盐（MTT）法测定大豆异黄酮和葡萄糖酸钙对体外培养成骨细胞的增殖作用，氨基安替比林法测成骨细胞内碱性磷酸酶（ALP）活性，茜素红染色方法（ARS）测成骨细胞的矿化作用。结果单纯补钙对大鼠成骨细胞增殖、分化和矿化无显著促进作用，大豆异黄酮可显著地促进成骨细胞的增殖和分化，并促使成骨细胞形成矿化结节，而补充大豆异黄酮同时补钙使矿化结节团块增大。结论大豆异黄酮可以提高成骨细胞的增殖和分化，同时补钙更有利成骨细胞的矿化。4．大豆异黄酮对体外培养大鼠成骨细胞BMP2表达的影响目的探讨大豆异黄酮对体外培养大鼠成骨细胞骨形态发生蛋白-2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）表达的影响。方法制作新生大鼠颅骨成骨细胞体外培养模型，用不同浓度的大豆异黄酮刺激分离培养的大鼠成骨细胞，提取细胞总RNA，RT-PCR扩增BMP2基因cDNA，同时扩增β-actin cDNA作为内对照。通过免疫组化方法观察大豆异黄酮对成骨细胞BMP2表达的影响，HPIAS图像分析仪对各组表达进行定量。扫描PCR产物电泳照片，计算BMP-2/β-actin cDNA的积分光密度比值，推算BMP2基因的相对表达水平。结果大豆异黄酮增加成骨细胞BMP2水平，并且在基因转录水平促进大鼠成骨细胞BMP2表达，呈剂量效应关系，（p＜0.01）。结论大豆异黄酮在成骨细胞形成中对BMP2表达有显著促进作用。提示大豆异黄酮在促进成骨细胞增殖、分化的作用可能是通过增加BMP2基因的表达来实现的。第三部分大豆异黄酮和鸡冠花黄酮对废用性骨质疏松大鼠、去卵巢大鼠骨代谢指标及相关细胞因子的影响1．钙和鸡冠花黄酮类提取物对废用性骨质疏松大鼠的作用目的探讨钙和鸡冠花黄酮类提取物对废用性骨质疏松（disuse osteoporosis，DOP）大鼠的作用，为老年骨质疏松的防治提供依据。方法选用健康SD大鼠40只，雄性。随机分为5组，第1组、第2组分别为阴性对照和阳性对照，灌胃蒸馏水5ml/（kg·d），第2～5组制造废用性骨质疏松大鼠模型，第3、4、5组为预防组分别灌胃等量鸡冠花提取物，碳酸钙，鸡冠花提取物加钙溶液。实验8周后，测骨密度，股骨X线和CT值，测血清MDA、SOD及24h尿钙、羟脯氨酸（HOP）、尿肌酐（UCR）含量等。结果阳性组与阴性组比股骨重、灰分重、CT值、血清钙下降，尿钙、尿HOP升高（p＜0.05或0.01），预防组与阳性组比股骨重、CT值显著增加，碳酸钙组、鸡冠花加钙组灰分重显著增加（p＜0.05）。各预防组与阳性组比股骨X线密度明显增加。与阳性组比各预防组血清钙增加，尿钙、尿HOP减少（P＜0.05或＜0.01）。鸡冠花组、鸡冠花加钙组与阳性组比股骨BMD、血清SOD升高，MDA降低，单纯补钙组仅BMD升高（P＜0.05或＜0.01）。结论补鸡冠花提取物、补钙对废用性骨质疏松大鼠骨质代谢均有促进作用，两者合用具有更好的预防效果，能延缓或减轻DOP的发生。2．鸡冠花黄酮对去卵巢大鼠尿无机盐、BMP2以及对单核吞噬细胞吞噬功能的影响目的探讨鸡冠花黄酮化合物对卵巢切除（ovariectomy，OVX）大鼠尿无机盐、骨形成蛋白（BMP2）以及对单核吞噬细胞吞噬功能的影响。方法雌性SD大鼠21只，随机分为假手术组（sham），去卵巢组（OVX），去卵巢加鸡冠花黄酮组（Celosiae cristatae isoflavone，CCFV，100mg/kg·d），10周后测骨密度和尿液钙，钠，钾含量。用免疫组化法测骨骼中BMP2的表达，用单核吞噬细胞体外吞噬试验和碳廓清法测定吞噬细胞的吞噬功能。结果OVX组大鼠尿钙，钠显著增高，而尿钾及骨BMP2表达降低。CCFV组与OVX组比大鼠尿钙，钠显著降低，骨BMP2显著性升高。OVX组与sham组比较大鼠单核吞噬细胞体外吞噬鸡红细胞的能力有显著降低（P＜0.05或＜0.01）；CCFV有提高单核吞噬细胞吞噬功能的作用。结论鸡冠花黄酮类化合物可调节OVX无机盐代谢表达，增加BMP2表达，促进吞噬细胞吞噬功能，预防骨质疏松。3．大豆异黄酮和钙对去卵巢大鼠无机盐、BMD、骨BMP2、TGF-β1、骨IGF-1、IGF-1mRNA表达影响目的探讨大豆异黄酮和钙对去卵巢大鼠的骨密度、无机盐、骨形成蛋白2（BMP2）和转移生长因子-β1（TGF-β1）、骨IGF-1、IGF-1mRNA表达的影响。方法28只雌性SD大鼠随机分为假手术（sham组）、去卵巢（OVX组）、去卵巢补钙(Ca组，50mg·kg-1·d-1)和去卵巢加大豆异黄酮(SIFV组，大豆异黄酮100mg·kg-1·d-1)，10周后测骨密度及血清、尿液和骨骼钙、钠、钾含量。并用SP免疫组织化学检测骨BMP2、TGF-β1、骨IGF-1表达。用原位杂交法测IGF-1mRNA表达。用HPIAS图像分析仪对各组表达进行定量分析。结果实验结束后，去卵巢大鼠的骨密度，骨骼钙显著下降，尿钙显著性增高（P＜0.01和P＜0.05），骨BMP2表达下降；与单纯去卵巢组比，大豆异黄酮组大鼠的骨密度、骨骼中钙显著升高，血清钙及尿钙显著性下降（P＜0.01和P＜0.05），骨BMP2表达增高（P＜0.05），而补钙组各指标都无显著性意义。去卵巢加大豆异黄酮后骨TGF-β1显著高于OVX组（P＜0.05），IGF-1免疫组化和IGF-1mRNA原位杂交平均吸光度值亦显著高于OVX组（P＜0.05或P＜0.01）。结论大豆异黄酮可能通过调节去卵巢大鼠的无机盐、骨BMP2、TGF-β1、IGF-1表达进而在预防骨质疏松症的发生中起到一定的作用。4．大豆异黄酮和钙对去卵巢大鼠骨密度、矿物质及肾脏TGFβ1表达的影响目的探讨大豆异黄酮和钙对OVX大鼠的骨密度及微量元素的影响。方法28只雌性SD大鼠随机分为假手术（sham组）、去卵巢（OVX组）、去卵巢补钙(Ca组，50mg·kg-1·d-1)和去卵巢加大豆异黄酮(SIFV组，大豆异黄酮100mg·kg-1·d-1)，10周后测骨密度和骨矿物含量及血清、尿液和骨骼钙、锌、铜、铁含量。结果实验结束时，OVX组与sham组相比骨密度和骨矿物含量，骨骼钙、锌、铜、铁和血清锌、铁显著下降，血清钙、铜、ALP及尿钙、铜、铁显著性增高（P＜0.05）；与OVX组比，SIFV组大鼠的骨密度、骨矿物含量、血清锌、骨骼中钙、锌、铜显著升高，血清钙、铜、ALP及尿钙、铜的丢失显著性下降（P＜0.01和P＜0.05），OVX组与sham组相比肾重/体重（％）显著增加（P＜0.01），SIFV组与OVX组比肾重/体重（％）明显降低（P＜0.01）。对大鼠肾小球内TGFβ1蛋白表达情况并进行计算机图像分析，显示OVX组与sham组相比肾小球TGFβ1表达显著升高（P＜0.01），而SIFV组与OVX组比TGFβ1表达显著降低（P＜0.01），而补钙组各指标都无显著性意义。结论大豆异黄酮可预防OVX骨钙、锌、铜丢失，抑制肾脏TGFβ1蛋白的过度表达，减轻肾脏损伤，预防骨质丢失。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 老年膳食营养与骨质疏松关系分析
• 对象与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 大豆异黄酮和鸡冠花黄酮对体外培养新生大鼠成骨细胞增值、分化及部分相关蛋白与基因表达的影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 大豆异黄酮和鸡冠花黄酮对废用性骨质疏松大鼠、去卵巢大鼠骨代谢指标的影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 本课题结论
• 植物黄酮类与骨质代谢 （综述）
• 英文缩写
• 博士期间发表的论文
• 本项目研究成果被引用情况
• 博士期间科研鉴定、获奖
• 博士期间科研查新报告
• 致谢