论文摘要
[背景]随着社会经济的发展和人民生活水平的提高,糖尿病的患病率日渐增高。糖尿病所引起的一系列急、慢性并发症极大地降低了糖尿病患者的生活质量和生存率。目前,全球糖尿病患者人数已达到2.5亿,而这个数字在未来的20年内将上升至3.8亿。因此,糖尿病已成为一种严重威胁全球人类健康的疾病。近年来,大量流行病学研究发现,糖尿病患者结直肠癌的发病率显著高于非糖尿病人群。糖尿病与结直肠癌的发生可能存在着密切联系。有学者认为晚期糖基化终产物（advanced glycation end products, AGEs）与其受体RAGE的相互作用可能是糖尿病患者包括结直肠癌在内的各种恶性肿瘤发病率增加的重要机制之一。AGEs为还原糖如葡萄糖等的羰基与蛋白质、脂质的游离氨基端,通过非酶糖基化作用（Mailard反应）形成可逆的Schiff碱,并经一系列的分子重排形成酮氨类化合物（Amadori products）,再进一步脱水和凝聚,形成不可逆的终产物。糖尿病的高血糖状态会促使糖基化进程加快,导致体内AGEs蓄积。在机体的组织和细胞中均存在AGEs受体,其中RAGE是研究最为深入的AGEs受体。以往研究认为,AGEs与RAGE结合后可启动一系列受体后信号转导通路,导致多种细胞因子与生长因子的合成与释放,引起血管内皮损伤、血流动力学和血液流变学改变、细胞基质异常增生等病理变化,从而参与了糖尿病慢性并发症的发生和发展。目前研究认为,AGEs-RAGE途径还与肿瘤形成相关,其可能机制是AGEs通过与RAGE相互作用促进氧化应激的产生,导致DNA损伤,而氧化应激反过来又促进AGEs的形成并上调RAGE的表达；另外,AGEs-RAGE介导的ROS水平增多可以激活多条与细胞增殖和凋亡相关的信号通路,最终促进了癌细胞的生长。目前,关于AGEs-RAGE途径与结直肠癌之间的研究较少,因此有必要进行更多、更深入的研究。近年来,尽管糖尿病的治疗和癌症的关系引发了一些争议,甚至有流行病学研究提示胰岛素和磺脲类药物可能增加患癌症风险。但是,另外一些研究却发现：罗格列酮作为一种胰岛素增敏剂除了可以降血糖外,还具备抑制肿瘤细胞增殖的作用。罗格列酮是PPAR-γ的一种合成配体,作为PPAR-γ激动剂,它除了可以增加胰岛素敏感性、调节血脂、抗炎等作用外,它和其他PPAR-γ配体在肿瘤发生、发展中的作用受到了广泛的关注。在多种恶性肿瘤细胞（肺癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌等）实验研究中,发现PPAR-γ配体可以通过促进细胞分化、细胞周期阻滞,诱导细胞凋亡,抑制肿瘤血管形成和下调基质金属蛋白酶以抑制肿瘤细胞的侵袭性等机制发挥抗癌作用。目前,关于PPAR-γ与结直肠癌的关系尚存分歧。尽管大多数研究肯定了PPAR-γ在结直肠肿瘤的抑制作用,但也有部分实验得出了与之相反的结果。因此,需要更多、更细致的研究来证实PPAR-γ在结直肠肿瘤中的作用。既往研究提示,PPAR-γ激动剂可以抑制.AGEs诱导的促动脉粥样硬化和促炎作用。在血管平滑肌细胞、脐静脉内皮细胞的研究中,有学者发现PPAR-γ激动剂可以通过下调RAGE的表达来抑制AGEs-RAGE途径,从而减轻AGEs引起的促动脉粥样硬化作用；在人单核细胞源树突状细胞（DC）中,罗格列酮可以减轻AGEs的促T淋巴细胞增殖作用,抑制了DC细胞因子IL-10、IL-12、INF-γ的分泌,从而发挥了抗炎作用。那么,在结肠癌细胞中,罗格列酮是不是也可以抑制.AGEs诱导的促增殖作用呢?目前鲜见报导。因此,本研究拟采用人结肠癌细胞SW-480,观察罗格列酮和AGEs对其增殖的影响,并探讨其可能机制。为糖尿病患者结肠癌的防治提供理论依据。本研究包括以下三部分：第一章AGEs对人结肠癌细胞SW-480增殖的影响及机制研究[目的]观察不同浓度AGEs对人结肠癌细胞SW-480细胞增殖的影响,并探讨其可能机制。[研究对象和方法]1、以人结肠癌细胞株SW-480细胞为实验对象；SW-480细胞株培养于含37℃、5%CO2、10%胎牛血清、1%青链霉素的RPMI 1640完全培养基中,隔天传代1次。2、体外制备AGEs修饰牛血清白蛋白（AGE-BSA）和BSA：将BSA与葡萄糖混合于37℃孵育60天,4℃透析24h以去除未结合的葡萄糖。体外制备的AGE-BSA经荧光分光光度计鉴定,AGEs含量为102.67U／mg蛋白,BSA对照为12.84U／mg。3、MTT测细胞活力情况：取生长对数期的细胞消化成单细胞,以细胞数3000个／孔接种至96孔培养板,每孔100ul。细胞贴壁后以无血清培养基继续培养24h,然后进行分组干预,分为正常对照组、AGEs组（100ug/ml、200ug/ml、500ug/ml）组、BSA组（500ug/ml）组,并设置空白对照组（培养液中无细胞）,每组7复孔,孵育24h后,每孔加MTT （4mg/ml） 20ul,继续孵育4h,弃上清,加150ulDMSO,振荡10分钟后用酶标仪上测各孔490nm处吸光值（OD值）。4、流式细胞术测细胞周期：取生长对数期的细胞消化,接种到6孔板中,细胞贴壁后以无血清RPMI1640培养液培养24h后进行干预,分为正常对照组和AGEs组（200ug/ml）,继续培养24h后消化收集细胞,预冷PBS洗两遍,70%预冷乙醇4℃固定过夜,固定后细胞用PBS洗两遍,离心弃PBS,加入PI染液（碘化丙啶及RNase A终浓度均为50ug/ml）避光染色30 min,进行流式细胞仪检测。5、实时荧光定量PCR法测定Cyclin D1 mRNA和RAGE mRNA的表达：收取对照组及200ug/mlAGEs组干预24h后的细胞。Trizol法提取细胞总RNA,实时定量PCR检测细胞中RAGE mRNA和cyclin D1 mRNA表达情况。以β-actin作为内参。6、数据以均数±标准差表示,应用SPSS 13.0软件进行统计分析。多组间数据的比较采用单向方差分析,若方差不齐采用Welch近似方差分析；多重比较采用LSD法（Least-significant difference test）,如果方差不齐采用Dunnett’s T3检验。两个独立样本比较采用t检验。P<0.05被认为差异具有统计学意义。[结果]1、细胞活力的比较：与正常对照组比较,100ug/ml、200ug/ml、500ug/ml AGEs分别作用SW-480细胞24h后均可以显著促进人结肠癌细胞SW-480的增殖（F=42.007,P<0.05）,这种促进作用呈浓度依赖性（P<0.05）。2、细胞周期的比较：流式细胞术结果示,200ug/ml AGEs干预SW-480细胞24h后,正常对照组和AGEs组G1期百分率分别为43.558±1.089、36.640±1.068,两组比较有统计学差异（t=10.143,P<0.001）；S期百分率分别为33.960±1.701、44.146±5.440,两组间有统计学差异（t=-3.996,P=0.011）；G2／M期百分率分别为22.482±0.946、19.214±4.393,差异无统计学意义（t=1.626,P=0.173）。3、Cyclin D1 mRNA的表达：实时荧光定量PCR示：Cyclin D1 mRNA表达量为正常对照组的1.585倍（P<0.05）。4、RAGE mRNA的表达：实时荧光定量PCR示：RAGE mRNA表达量为正常对照组的1.94倍（P<0.05）。[结论]1、AGEs可以促进SW-480细胞的增殖,促进作用呈浓度依赖性。2、AGEs可以促进SW-480细胞RAGE和Cyclin D1的表达,加速细胞G1期向S期转换,进而促进了SW-480细胞的增殖。第二章罗格列酮对人结肠癌细胞SW-480增殖的影响及机制研究[目的]观察不同浓度罗格列酮对人结肠癌细胞SW-480细胞增殖的影响,并探讨其可能机制。[研究对象和方法]1、以人结肠癌SW-480细胞为实验对象,培养方法同前；2、罗格列酮母液的配制方法：取10mg罗格列酮粉末,加入560ul DMSO中溶解,以50mmol/L浓度-20℃保存。3、MTT测细胞增殖情况：实验分组为：正常对照组、罗格列酮组（0.1umol/L、1umol/L、10umol/L）组。具体检测方法同第一章。4、流式细胞术测细胞周期：实验分组为：正常对照组、罗格列酮组（1umol/L）组。具体检测方法同第一章。5、实时荧光定量PCR法测定Cyclin D1 mRNA表达：实验分组为：正常对照组、罗格列酮组（1umol/L）组。具体检测方法同第一章。6、数据以均数±标准差表示,应用SPSS13.0软件进行统计分析。多组间数据的比较采用单向方差分析,若方差不齐采用Welch近似方差分析；多重比较采用LSD法,如果方差不齐采用Dunnett’s T3检验。两个独立样本比较采用t检验。P<0.05被认为差异具有统计学意义。[结果]1、细胞活力的比较：0.1umol/L、1umol/L、10umol/L罗格列酮分别作用于SW-480细胞24h后均可以抑制人结肠癌细胞的活力,这种抑制作用呈浓度依赖性（F=34.339,P<0.05）。其中0.1umol/L罗格列酮对细胞的抑制作用与正常对照组比较无统计学差异（P=0.395）；1umol/L和10umol/L罗格列酮组与正常对照组比较均有统计学差异（P<0.05）2、细胞周期的比较：流式细胞术结果示,1umol/L罗格列酮干预SW-480细胞24h后,正常对照组和罗格列酮组G1期百分率分别为43.558±1.089、50.488±1.773,两组间有统计学差异（t=-7.448,P<0.001）；S期百分率分别为33.96±1.701、26.594±2.162,两组间有统计学差异（t=5.988,P<0.001）；G2／M期百分率分别为22.482±0.946、22.918±0.728,差异无统计学意义（t=-8.17,P=0.438）。3、CyclinD1 mRNA的表达：实时荧光定量PCR示：Cyclin D1 mRNA表达量为正常对照组的0.825倍。（P<0.05）4、RAGE mRNA的表达：实时荧光定量PCR示：RAGE mRNA表达量为正常对照组的0.809倍（P<0.05）。[结论]1、罗格列酮可以抑制SW-480细胞的增殖,抑制作用呈浓度依赖性。2、罗格列酮可以抑制SW-480细胞Cyclin D1的表达,减慢细胞G1期向S期转换,进而抑制了SW-480细胞的增殖。第三章罗格列酮对AGEs诱导的人结肠癌细胞SW-480增殖的影响及机制研究[目的]观察罗格列酮对AGEs诱导的人结肠癌细胞SW-480细胞增殖的影响,并探讨其可能机制。[研究对象和方法]1、以SW-480为实验对象,培养方法同前；2、体外制备AGEs修饰牛血清白蛋白（AGE-BSA）同第一章。3、实验分组为：正常对照组、200ug/mlAGEs组,200ug/ml AGEs+1umol/L罗格列酮组。4、各组在干预24h后,MTT法测定细胞活力,流式细胞术检测细胞周期,实时荧光定量PCR法测定CyclinD1 mRNA、RAGE mRNA的表达,检测方法同第一章；5、数据以均数±标准差表示,应用SPSS13.0软件进行统计分析。多组间数据的比较采用单向方差分析,若方差不齐采用Welch近似方差分析；多重比较采用LSD法,如果方差不齐采用Dunnett’s T3检验。P<0.05被认为差异具有统计学意义。[结果]1、细胞活力的测定：与正常对照组比较,200ug/mlAGEs能显著促进SW-480细胞的增殖（P<0.05）；1umol/L罗格列酮+200ug/mlAGEs组与AGEs组比较可以显著抑制SW-480细胞的增殖（P<0.05）。2、细胞周期的测定：正常对照组、200 ug/mlAGEs;组、1umol/L罗格列酮+200ug/mlAGEs组培养24h后G1期百分率分别为55.81±0.63,36.640-±1.068,40.366±1.281,三组间存在统计学差异（F=45.329,P<0.05）,其中AGEs组与正常对照组比较有显著统计学差异（P<0.05）,罗格列酮+AGEs组与AGEs组比较有显著统计学差异（P<0.05）；S期百分率分别为33.960±1.701,44.146±5.440,35.340±3.472,三组间存在显著统计学差异（F=10.282,P<0.05）；其中罗格列酮+AGEs组与AGEs组比较有显著统计学差异（P<0.05）；G2／M期百分率分别为22.482±0.946,19.214±4.393,23.334±2.981,组间无统计学差异（F=2.194,P=0.192）。3、Cyclin D1 mRNA:AGEs组Cyclin D1 mRNA的表达量约为正常对照组的1.588倍（P<0.05）；罗格列酮+AGEs组Cyclin Dl mRNA的表达量约为正常对照组的1.242倍（P<0.05）；罗格列酮+AGEs组与AGEs组Cyclin D1 mRNA的表达量比较具有统计学差异（t=6.752,P<0.001）。4、RAGE mRNA:AGEs组RAGE mRNA的表达量约为正常对照组的1.937倍（P<0.05）；罗格列酮+AGEs组RAGE mRNA的表达量约为正常对照组的1.518倍（P<0.05）；罗格列酮+AGEs组与AGEs组RAGE mRNA的表达量比较具有统计学差异（t=7.510,P<0.001）。[结论]1、罗格列酮可以抑制AGEs诱导的人结肠癌细胞SW-480的促增殖作用。2、罗格列酮可以抑制AGEs诱导的Cyclin D1和RAGE的上调作用,进而通过细胞周期调控,减慢细胞G1期向S期转换,最终抑制了SW-480细胞的增殖。
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