砀山酥梨石细胞发育过程中POD酶学特性及POD克隆

论文摘要

砀山酥梨属白梨系品种，是我国栽培面积最大的梨品种之一，但近年来，由于品种退化和管理粗放等原因，砀山酥梨出现了石细胞含量增多，口感多渣等问题，严重影响了砀山酥梨的品质和经济价值。石细胞是由细胞壁次生加厚、木质素沉积而形成的，因此，木质素的合成、转运和沉积与石细胞的发育有着密切的关系。过氧化物酶（POD）是木质素合成过程中参与最后一步反应的关键酶，在苯丙烷代谢形成香豆醇、松柏醇、芥子醇三种单体之后，单体在POD作用下脱氢聚合形成木质素。目前，在植物体内参与木质素生物合成的POD的类型还不清楚，该酶的底物尚未查明。因此，本试验以砀山酥梨为材料，对果实发育不同时期，参与木质素合成的POD类型进行研究，以期阐明梨果实石细胞形成过程中POD在木质素代谢途径中的作用，也为今后通过基因工程手段抑制梨果实木质素合成及单体聚合，控制石细胞含量提供理论依据。主要研究结果如下：1.在砀山酥梨果实发育过程中，位于石细胞细胞壁及邻近区域的POD参与木质素在石细胞细胞壁上的沉积；2.花后15～123d，POD同工酶谱带主要分为3组酶活性区，其中PODⅠRf值为0.13～0.23，PODⅡ为主要酶带，R f值为0.44，P ODⅢ的Rf值为0.63～0.96； PPOD是砀山酥梨果实发育过程木质素代谢关键酶POD的主要类型，参与木质素的合成，促进石细胞的发育。3.在砀山酥梨果实发育过程中，GSH-PX在花后27d出现高峰，酶活大小高达611.76U g-1min-1， PPOD共有3个活性高峰期，分别出现在花后31d、43d和55d，其酶活变化分别为184.5U g-1min-1、221.4U g-1min-1和242.9U g-1min-1；梨果实中APX在花后47d达到高峰期，酶活性为35.48U g-1min-1；石细胞含量高峰期出现在花后51d，为17.82％；木质素含量高峰期分别出现在花后47d和63d，分别为6.47%和7.00%。4.砀山酥梨果实PPOD的最适pH为6.5，最适温度为35℃；最适底物浓度为0.02mol L-1， Km值为4.4×10-2 m mol L-1。5.采用RT-PCR和3’RACE克隆了砀山酥梨果实中POD基因的cDNA部分片段，该大小为833bp，含有41bp的3’非编码区，792bp的编码区，编码264个氨基酸，与陆地棉等植物的POD基因的氨基酸序列具有60%-81%的同源性；与陆地棉中POD的亲缘关系最近，与菠菜中POD的亲缘关系最远。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 国内外研究动态
• 1.1.1 梨石细胞与果实品质
• 1.1.2 石细胞的形成过程
• 1.1.3 木质素代谢与石细胞形成
• 1.1.4 木质素代谢
• 1.1.5 POD 的研究进展
• 1.1.6 GSH-PX
• 1.1.7 APX
• 1.1.8 PPOD
• 1.1.9 POD 的克隆及生物信息学研究进展
• 2 引言
• 3 材料与方法
• 3.1 试验材料
• 3.2 主要试剂和仪器
• 3.2.1 主要试剂
• 3.2.2 主要仪器
• 3.3 试验设计与技术路线
• 3.4 测定项目及方法
• 3.4.1 石细胞含量测定
• 3.4.2 木质素含量测定
• 3.4.3 POD 的组织化学定位
• 3.4.4 POD 同工酶电泳
• 3.4.5 GSH-PX 活性测定
• 3.4.6 APX 活性测定
• 3.4.7 PPOD 活性测定
• 3.4.8 PPOD 酶活特性
• 3.4.8.1 最适 pH
• 3.4.8.2 最适温度
• 3.4.8.3 最适底物浓度与 Km
• 3.4.9 POD 基因克隆
• 3.4.9.1 砀山酥梨果实中 RNA 的提取与检测
• 3.4.9.2 POD 基因 cDNA 保守区的克隆
• 3.4.9.3 3’RACE
• 4 结果与分析
• 4.1 砀山酥梨果实发育过程中 POD 组织化学定位分析
• 4.2 砀山酥梨果实中 POD 同工酶谱带分析
• 4.3 砀山酥梨果实发育过程中石细胞含量，木质素含量及 POD 酶活性变化
• 4.3.1 石细胞含量、木质素含量的变化
• 4.3.2 GSH-PX，PPOD、APX 酶活性变化
• 4.3.3 GSH-PX，PPOD 和 APX 活性变化与石细胞含量间的逐步回归分析及通径分析
• 4.3.4 GSH-PX，PPOD、APX 活性变化与木质素含量间的逐步回归分析及通径分析
• 4.4 PPOD 酶学特性分析
• 4.4.1. 最适 pH
• 4.4.2. 最适温度
• 4.4.3. 最适底物浓度与 Km
• 4.5 POD 的克隆及生物信息学分析
• 4.5.1 砀山酥梨总 RNA 样品的电泳检测
• 4.5.2 POD 的 cDNA 保守区的克隆
• 4.5.3 POD 基因 cDNA 的 3’RACE 的克隆
• 4.5.4 砀山酥梨果实中 POD 基因 CDNA 片段的获得与序列分析
• 5 讨论
• 5.1 砀山酥梨果实发育过程中 POD 组织化学定位及其类型分析
• 5.2 PPOD 的酶学特性
• 5.3 POD 的基因克隆
• 6 结论
• 参考文献
• 附录
• 缩写词
• 致谢
• 作者简介
• 在读期间发表的论文