绿色木霉葡聚糖内切酶EGIII基因在大肠杆菌中的表达及其分子进化的研究

论文摘要

纤维素是地球上最丰富的可再生性物质之一,如果能够利用纤维素来生产燃料乙醇将缓解人类面临的能源和环境污染等危机,因此纤维素乙醇已被人们看作未来能源。纤维素原料是最有发展潜力的燃料乙醇生产原料,但因其结构致密很难被分解成微生物利用的糖类,是目前利用其工业化生产乙醇首要面临的困难。纤维素酶是能够水解纤维素的一类酶的总称,它可以将纤维素水解成单糖,进而发酵产生乙醇,然而目前发现纤维素酶活力低,成本高,严重制约了其工业化应用。针对纤维素酶活力低,以及纤维素酶基因在大肠杆菌中表达无活力的问题,本论文做了以下研究:将绿色木霉EGⅢ基因亚克隆到表达载体pET-22b（+）,构建重组质粒pET-egl3,转化大肠杆菌BL21（DE3）,检测到EGⅢ酶活,利用金属亲和层析对重组EGⅢ进行纯化,SDS—PAGE显示纯化蛋白的分子量约为42kD,纯化后的酶比活力为6U/mg,最适反应温度为60℃,最适pH为4.0。由于对绿色木霉内切葡聚糖酶EGⅢ的三维结构尚不清楚,本研究采用了非理性设计进行内切葡聚糖酶EGⅢ分子进化的研究,利用定点饱和突变的方法来获得高活力突变酶。以Thermoascus aurantiacus内切酶的晶体结构,通过SWISSMODEL（http://www.expasy.org/）同源建模绿色木霉EGⅢ的3D结构,分析模板关键位点,结合计算机辅助设计软件Prosa2003能量计算确定了EGⅢ催化区内的R130、E218、Q246和E329为突变位点。利用刚果红染色法进行筛选,从Q246和E329突变库中没能筛选到有活力提高的突变体,而R130和E218各筛选到一株酶活有提高的突变子R130P和E218F,比活为野生型EGⅢ的2.8倍和3.45倍。对其酶学性质的研究发现,突变酶E218F的Km提高了一倍,催化效率Kcat提高了5.4倍;而R130P的Km和Kcat没有明显变化。两个突变酶的最适酶解温度和pH分别都提高至65℃和4.4。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 一、纤维素乙醇的研究概况
• 二、纤维素和纤维素酶的研究概况
• 三、内切纤维素酶的分子进化的研究概况
• 四、本论文研究的目的意义
• 五、本实验技术路线
• 第一章 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1.菌株与质粒
• 1.1.2.酶与试剂
• 1.1.3.主要仪器设备
• 1.2 方法与步骤
• 1.2.1.大肠杆菌感受态的制备
• 1.2.2.质粒DNA的大量制备
• 1.2.3.质粒DNA的小量制备
• 1.2.4.质粒pET-22b（+）/egl3的构建
• 1.2.5.刚果红染色法
• 1.2.6.重组菌株的诱导表达
• 1.2.7.外源基因在大肠杆菌中的表达检测
• 1.2.8.蛋白质的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 1.2.9.大肠杆菌细胞的破碎与粗酶液的制备
• 1.2.10.葡聚糖内切酶EGⅢ的纯化
• 1.2.11.葡聚糖内切酶EGⅢ的活力测定
• 1.2.12.蛋白质浓度测定
• 1.2.13.定点饱和突变库的构建
• 1.2.14.野生型和突变酶动力学性质比较
• 第二章 结果与分析
• 2.1 野生型葡聚糖内切酶EGⅢ基因EGL3在大肠杆菌中的表达
• 2.1.1.egl3基因的亚克隆
• 2.1.2.EGⅢ的表达及SDS-PAGE分析
• 2.2 定点饱和突变
• 2.2.1.突变点的选择
• 2.2.2.EGⅢ定点饱和突变表达质粒的构建
• 2.2.3.突变型egl3基因的序列分析
• 2.3 野生型和突变酶酶学性质比较
• cat值的测定'>2.3.1.野生型和突变酶的比活活力、Km值和K_cat值的测定
• 2.3.2.最适温度和最适pH的比较
• 2.3.3.野生酶和突变酶的热稳定性的比较
• 第三章 讨论
• 3.1 EGⅢ的定向进化
• 3.1.1.同源建模
• 3.1.2.ProSa2003对突变位点的分析
• 3.1.3.突变酶的分析
• 第四章 结论与展望
• 4.1 结论
• 4.2 问题与展望
• 参考文献
• 附录1
• 1、溶液
• 2、培养基
• 附录2
• 1.葡萄糖标准曲线的制作
• 2.蛋白质浓度测定
• 附录3
• 突变体序列比对结果
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文