栉孔扇贝对急性病毒性坏死症病毒的生理和免疫应答

论文摘要

栉孔扇贝(Chlamys farreri)是我国北方重要养殖扇贝种类,在海湾扇贝和虾夷扇贝引进以前,其年产量占我国扇贝总产量的80%。但自1997年以来,我国北方大部分养殖区连续发生养殖栉孔扇贝大批死亡事件,严重影响和损害了栉孔扇贝养殖业的发展。我国栉孔扇贝大规模死亡是多种因素综合作用的结果。大致可分为生物因素与非生物因素:非生物的因素有夏季水温过高、养殖密度过高、养殖环境退化等。生物因素有流行性病原生物的侵害和扇贝种质的退化等。其中,急性病毒性坏死症(Acute Viral Necrobiotic Disease, AVND)病毒造成栉孔扇贝大规模死亡现象的研究已经开展。本研究通过生理学、免疫学技术和手段研究栉孔扇贝对急性病毒性坏死症病毒的生理和免疫应答,以期更好的了解栉孔扇贝对这一病毒的防御机制,为扇贝病害防治提供资料。本研究对不同温度下栉孔扇贝感染AVND病毒后的耗氧率和排氨率进行了测定。结果显示,在17℃下,病毒组和注射生理盐水组栉孔扇贝的耗氧率逐渐升高,但两者无显著差异;方差分析显示,各组间排氨率的变化无显著差异。在25℃下,栉孔扇贝闭壳肌注射AVND病毒和注射生理盐水组栉孔扇贝的耗氧率逐渐升高,在12小时取得最大值,对照组则变化不大。方差分析显示,注射病毒组与注射生理盐水组和对照组之间有显著差异(P<0.05)。同时,对栉孔扇贝感染AVND病毒的致病剂量进行了研究,在25℃水温下,栉孔扇贝肌肉注射感染AVND病毒后,只有150μl组表现出明显患病症状并在第三天开始出现死亡现象,注射50、100μl组则无明显症状;17℃下栉孔扇贝感染AVND病毒后无明显患病症状,表明AVND病毒对栉孔扇贝的感染致病具有剂量和温度依赖性。对于25℃水温下栉孔扇贝感染AVND病毒后血清中相关免疫酶类活力变化进行了测定。栉孔扇贝感染AVND病毒后血清中SOD的活性逐渐升高,在48小时达到最大值,方差分析显示不同时间点之间的SOD活性有显著差异(P<0.05),在48小时,病毒组和生理盐水组间的SOD活性有显著差异(P<0.05),在其它时间点无显著差异。酸性磷酸酶(ACP)的活力在感染病毒2小时后升高,在12小时下降,然后又升高,在48小时达到最大值。方差分析显示不同时间点之间的ACP活性有显著差异(P<0.05),在2小时和48小时,病毒组和生理盐水组间的ACP活性有显著差异(P<0.05)。碱性磷酸酶(AKP)的活力变化趋势与ACP相同,在24小时达到最大值。方差分析显示不同时间点之间的AKP活性有显著差异(P<0.05)。在2小时、12小时、24小时病毒组和生理盐水组间有显著差异(P<0.05)。栉孔扇贝酚氧化酶的活性最大值在48小时,但与生理盐水对照组之间无显著差异。溶菌酶(Lysozyme)活性在病毒组和生理盐水对照组间无显著差异,病毒组最大值在2小时取得,对照组在24小时取得。结果表明栉孔扇贝通过升高或调节自身免疫相关蛋白酶类合成应对AVND病毒侵染。采用荧光实时定量PCR技术,对栉孔扇贝感染AVND病毒后免疫相关基因的时空表达规律进行了研究。水温17℃下,栉孔扇贝肌肉注射感染AVND病毒后超氧化物歧化酶(SOD)基因mRNA的表达量逐渐上升,在注射后24小时达到最大值,约为空白对照组的1.8倍,方差分析显示,病毒组SOD的表达量不同时间点之间有显著变化(P<0.05);但与生理盐水对照组相比较,病毒组SOD表达量无显著差异。在水温25℃下SOD基因mRNA的表达量逐渐上升,在注射后6小时达到最大值,约为对照组的1.5倍,空白对照组的2.2倍。病毒组SOD的表达量不同时间点之间有显著差异(P<0.05);在感染后2、6、12、24小时病毒组SOD表达量比对照组有显著升高(P<0.05)。溶菌酶基因在肝胰脏中的表达升高,在6小时达到最大值,约为生理盐水对照组的1.5倍,空白对照组的2.7倍,在48小时取得最小值(低于空白对照组)。病毒感染后不同时间之间溶菌酶基因表达有显著差异(P<0.05),感染后6、24和48小时病毒组溶菌酶基因表达比对照组有显著升高(P<0.05)。在AVND病毒感染后6小时,在肝胰脏、性腺、肌肉、鳃中溶菌酶mRNA量急剧增加,分别达到了空白对照组的4.7倍、3.8倍、13.43倍和25.15倍。方差分析显示在不同组织部位的表达有显著差异(P<0.05)。表明AVND病毒感染后栉孔扇贝免疫相关基因的表达具有时序性和组织部位特异性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 一、我国栉孔扇贝养殖现状及病害情况
• 1.1 我国栉孔扇贝养殖业现状
• 1.2 栉孔扇贝球形病毒
• 二、无脊椎动物的先天性免疫系统
• 2.1 非己识别
• 2.2 免疫信号的调整和放大
• 2.3 病原体的清除
• 三、贝类免疫防御机制
• 3.1 贝类的细胞免疫
• 3.2 贝类的体液免疫
• 3.3 环境污染对贝类免疫系统的影响
• 3.4 贝类免疫系统对病原刺激的应答
• 四、海洋贝类病害学研究
• 4.1 原生生物引起的贝病
• 4.2 后生动物引起的贝病
• 4.3 原核生物类引起的贝病
• 4.4 细菌和真菌
• 4.5 病毒
• 五、荧光实时定量PCR检测目的基因的表达
• 5.1 荧光实时定量PCR 的原理
• 5.2 荧光实时定量PCR 的引物设计
• 5.3 实时定量PCR 体系的优化
• 六、本研究目的和意义
• 6.1 研究目的
• 6.2 本研究的意义
• 第二章 栉孔扇贝感染急性病毒性坏死症病毒后的生理代谢反应
• 一、研究背景
• 二、材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 三、实验结果
• 3.1 17℃ 下栉孔扇贝感染AVND 病毒不同时间后的耗氧率和排氨率的变化
• 3.2 25℃ 下栉孔扇贝感染AVND 病毒不同时间后的耗氧率和排氨率的变化
• 四、讨论
• 4.1 AVND病毒对栉孔扇贝的感染情况
• 4.2 栉孔扇贝感染AVND病毒后的生理代谢反应
• 4.3 AVND 病毒发病与温度的关系
• 第三章 栉孔扇贝对AVND病毒感染的相关酶类活力变化研究
• 一、研究背景
• 二、材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.3 数据处理
• 三、实验结果
• 3.1 栉孔扇贝感染AVND 病毒后超氧化物歧化酶活力的变化
• 3.2 栉孔扇贝感染AVND 病毒后酸性磷酸酶活力的变化
• 3.3 栉孔扇贝感染AVND 病毒后碱性磷酸酶活力的变化
• 3.4 栉孔扇贝感染AVND 病毒后酚氧化酶和溶菌酶活力变化
• 四、讨论
• 4.1 栉孔扇贝血清超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase）对AVND病毒感染的反应
• 4.2 AVND病毒对酸性磷酸酶（Acid Phosphatase）和碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase）活力的影响
• 4.3 AVND病毒对酚氧化酶（Phenoloxidase）活力的影响
• 4.4 AVND 病毒感染对溶菌酶（Lysozyme）活力的影响
• 第四章 栉孔扇贝感染AVND病毒后超氧化物歧化酶和溶菌酶基因时空表达变化
• 一、研究背景
• 二、材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.3 荧光实时定量PCR 检测目的基因的表达
• 2.4 指标计算与数据处理
• 三、实验结果
• 3.1 超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase）基因在不同温度下感染AVND 病毒不同时间后栉孔扇贝血细胞中的表达量变化
• 3.2 溶菌酶（lysozyme）基因在25℃ 下感染AVND 病毒不同时间后栉孔扇贝肝胰脏中的表达量变化
• 3.3 溶菌酶（lysozyme）基因在25℃ 下感染AVND 病毒后栉孔扇贝不同组织部位的表达量变化
• 四、讨论
• 4.1 栉孔扇贝感染AVND 病毒后血细胞中超氧化物歧化酶基因表达变化
• 4.2 栉孔扇贝感染AVND 病毒后溶菌酶基因的时空表达变化
• 第五章 栉孔扇贝不同水平免疫防御能力相关性分析
• 一 栉孔扇贝对AVND 病毒感染的生理应答
• 1.1 栉孔扇贝对AVND 病毒感染蛋白酶水平的免疫防御
• 1.2 栉孔扇贝感染AVND 病毒后免疫相关基因的时空表达
• 1.3 栉孔扇贝对AVND 病毒不同水平免疫防御能力相关性分析
• 参考文献
• 博士期间发表和完成的论文
• 致谢