北美—球悬铃木组织培养及利用安全筛选标记基因进行耐盐转基因研究

论文摘要

土壤盐渍化是一个世界性问题,在盐碱地上植树造林不仅可以改良和利用盐碱地,而且可以带来明显的经济效益和生态效益,因此,耐盐树种的选育是国内外林木育种工作者关注的热点问题。北美一球悬铃木（Platanus occidentalis L.）作为一种重要的园林绿化和工业用材树种,开展其组织培养和遗传转化研究是培育该树种耐盐新品种的有效途径。本文选用北美一球悬铃木为研究材料建立其体外组织培养再生体系,并在此基础上进行了耐盐Na+/H+逆向转运蛋白基因（AtNHX1）的遗传转化研究,主要结果如下:1)利用北美一球悬铃木叶片外植体,通过对分化、生根和移栽等体外再生过程的研究,建立了北美一球悬铃木高效稳定的体外再生体系。其分化培养基为WPM+6-BA(5.0 mgl-1)+IBA(0.1 mgl-1)+蔗糖（3%）,最大分化率达到90%,平均芽个数为13.72;壮苗培养基为MS+6-BA(0.3 mgl-1)+NAA(0.03 mgl-1)+腺嘌呤（2%）+蔗糖（3%）;生根培养基为1/2MS+IBA(0.1 mgl-1)+蔗糖（2%）。北美一球悬铃木再生苗经RAPD分子标记检测发现由组织培养引起的多态率在0.0104%以下,表明北美一球悬铃木体外再生植株遗传稳定性好。2)利用本实验室构建的含安全选择标记基因manA和耐盐AtNHX1基因的双T-DNA表达载体进行了北美一球悬铃木耐盐基因遗传转化研究,通过甘露糖敏感性测验发现,随甘露糖浓度增加,北美一球悬铃木不定芽分化率降低,表明北美一球悬铃木对甘露糖敏感,不能直接利用甘露糖进行代谢反应,因此可以利用甘露糖对转基因植株进行筛选;受体叶片与农杆菌共培养后,在含不同浓度的甘露糖和蔗糖的分化培养基上进行分化,不定芽经PCR检测结果显示,在含10gl-1甘露糖和15gl-1蔗糖的培养基上其转化效率为12.76%,因此确定该浓度组合为北美一球悬铃木甘露糖筛选适宜的选择压。（3）以北美一球悬铃木叶片为受体材料,通过根癌农杆菌介导转化和甘露糖筛选,获得了一批经PCR和氯酚红（CPR）检测均呈阳性的耐盐转基因植株。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1.悬铃木生物学特性及细胞工程研究进展
• 1.1 悬铃木生物学特性
• 1.2 悬铃木组织培养
• 2.植物遗传转化的选择标记
• 2.1 正向筛选体系
• 2.2 负向筛选体系
• 2.3 选择标记基因的安全性研究
• 3.林木耐盐基因工程研究进展
• 3.1 林木耐盐研究的必要性
• 3.2 林木耐盐转化的相关基因
• 3.3 林木耐盐转基因研究进展
• +/H⁺逆向转运蛋白的分离'>3.4 Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的分离
• +/H⁺逆向转运蛋白的功能特征'>3.4.1 Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的功能特征
• +/H⁺逆向转运蛋白基因的遗传转化研究'>3.4.2 Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因的遗传转化研究
• 4.研究课题的提出
• 第二章 北美一球悬铃木再生体系的建立及遗传稳定性研究
• 1.引言
• 2.材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 悬铃木叶片分化培养
• 2.2.2 悬铃木扩繁增殖培养
• 2.2.3 悬铃木壮苗与继代培养
• 2.2.4 悬铃木生根培养
• 2.2.5 悬铃木再生苗移栽
• 2.2.6 悬铃木再生植株的基因组DNA提取及RAPD分析
• 3.结果
• 3.1 北美一球悬铃木再生体系
• 3.2 不定芽的生根培养
• 3.3 北美一球悬铃木再植株的炼苗与移栽
• 3.4 北美一球悬铃木在生苗的遗传稳定性分析
• 4.讨论
• 4.1 北美一球悬铃木叶片再生
• 4.2 不定芽的增殖生长
• 4.3 不定芽生根
• 4.4 炼苗与移栽
• 4.5 遗传稳定性分析
• 第三章 北美一球悬铃木甘露糖筛选体系的建立
• 1.引言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 受体植物材料
• 2.1.2 农杆菌菌落
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 北美一球悬铃木不定芽分化对甘露糖的敏感性分析
• 2.2.2 农杆菌的培养
• 2.2.3 农杆菌与受体叶片共培养
• 2.2.4 甘露糖选择压力的筛选
• 2.2.5 PCR检测
• 3.结果
• 3.1 北美一球悬铃木不定芽分化对甘露糖敏感性分析
• 3.2 甘露糖选择压力的筛选
• 3.3 PCR检测
• 4.讨论
• 4.1 甘露糖筛选体系的优点
• 4.2 甘露糖筛选体系的影响因素
• 4.2.1 其他糖类物质对甘露糖筛选体系的影响
• 4.2.2 磷酸根离子浓度对转化体系的影响
• 第四章 农杆菌介导北美一球悬铃木耐盐转基因
• 1.引言
• 2.材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 受体植物材料
• 2.1.2 菌种和质粒
• 2.1.3 主要化学试剂、分子生物学试剂及仪器
• 2.1.4 常用缓冲液、抗生素及培养基
• 2.2 方法
• 2.2.1 农杆菌的培养
• 2.2.2 农杆菌与受体叶片共培养
• 2.2.3 抗性不定芽分化与筛选
• 2.2.4 植株再生与移栽
• 2.2.5 转基因植株的分析鉴定
• 3.结果与分析
• 3.1 北美一球悬铃木实生苗耐盐性分析
• 3.2 转基因植株的分析鉴定
• 3.2.1 PCR检测
• 3.2.2 氯酚红（CPR）法检测
• 4.讨论
• 第五章 结论与展望
• 参考文献
• 附录 缩略词表
• 硕士期间发表论文和项目资助情况
• 致谢