论文摘要
研究背景及目的：替莫唑胺（Temozolomide, TMZ）是一种口服安全有效的咪唑并四嗪类抗肿瘤药物,易透过血脑屏障,已作为一线抗脑癌化疗药物用于临床。TMZ主要烷化DNA鸟嘌呤6位形成06-甲基鸟嘌呤（06-MEG）而发挥细胞毒作用；但癌细胞中广泛存在06-烷基鸟嘌-DNA-烷基转移酶（06-methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT）,其能不可逆地将烷化基团从06-鸟嘌呤上转移到自身145位的半胱氨酸残基上而修复损伤的DNA,从而削弱TMZ的细胞毒作用。因此TMZ的发明者Malcolm Stevens教授提出了设计新的TMZ衍生物377、465,其可以像TMZ一样在生理条件下开环后烷化DNA,形成DNA加合物,但形成的DNA加合物不被MGMT识别与修复,且具有广谱的抗癌活性。此类衍生物已成功合成,但是目前的研究还未揭示此类衍生物是如何逃避MGMT的识别与修复机理,其烷化DNA形成的DNA加合物的药理作用机制也不清楚,因此本次研究目的意在探讨TMZ衍生物与DNA的结合；损伤DNA的机制；对细胞周期及凋亡的影响。研究方法：1、 MTT法首先检测TMZ衍生物对几种细胞系的半数抑制浓度。2、 紫外光谱法测定TMZ衍生物与DNA的相互作用。3、 流式细胞仪检测TMZ衍生物对U87MG和HCT1 16细胞周期的影响。4、 免疫荧光分析组蛋白H2AX的磷酸化（γ-H2AX）。5、Annexin-V-PI双染法检测细胞凋亡。6、 免疫印记检测TMZ衍生物对PARP、Caspase9、P53、p-P53、Chk2、p-Chk2这几种蛋白表达的影响。研究结果：1、 MTT实验说明TMZ衍生物的细胞毒性可能与MGMT和MMR修复无关,且其具有广谱抗癌作用。2、TMZ及其衍生物与DNA结合实验证明TMZ及其衍生物都能与DNA结合,但结合位点可能各不相同。3、TMZ衍生物对HCT116细胞周期的影响：对细胞周期具有阻滞作用。TMZ衍生物377能把细胞阻滞在G2-M期,且随着时间的推移,pre-G1越来越明显。465在低浓度或高浓度即20μM或50μ时,也能把细胞阻滞在G2-M期,且pre-G1峰比377处理相应时间后明显。4、TMZ衍生物对DNA双链的作用：H2AX磷酸化是检测DNA双链断裂标准。无论是对于HCT116细胞还是对于U87-MG细胞,377和465处理后,都能检测到γ-H2AX。说明377和465能引起DNA双链断裂。5、 衍生物凋亡实验：无论在结肠腺癌细胞HCT116中,还是在神经胶质瘤细胞U87-MG中,377和465作用细胞24h后,都能引起细胞凋亡。6、 免疫印迹检测周期阻滞蛋白及凋亡蛋白表达：377和465处理HCT116和U87-MG细胞后,p-P53、p-CHK2、PARP、Caspase-9活性都具有时间依赖性；377处理后,p-P53、p-CHK2的活性具有剂量依赖性。而465处理后,p-P53、p-CHK2、PARP、 Caspase-9活性也具有时间依赖性,但没有明显的剂量依赖性。377和465都能对凋亡相关蛋白和周期阻滞蛋白有影响。