论文摘要
目的研究复制缺陷性腺病毒携带抗增殖性基因p21基因转染左向右分流型先心病肺动脉高压大鼠模型的可行性，观察转染后目的基因的表达情况，及其对肺动脉高压的抑制作用和对肺动脉平滑肌细胞增殖和凋亡的影响。方法以含全长人p21基因的cDNA的质粒（pCEP-waf1）为模板，聚合酶链反应（PCR）扩增全长p21基因编码区cDNA，将其与穿梭质粒采用相同的限制性内切酶（XbaⅠ和KpnⅠ）分别酶切，连接将p21装入穿梭质粒，再将穿梭质粒、E1及E3区缺失的5型腺病毒经相同限制性内切酶（PⅠ-SceⅠ和Ⅰ-CeuⅠ）分别酶切，连接获得携带目的基因的重组腺病毒（Adeno-p21），该病毒经PacⅠ酶切线性化后采用脂质体转染（Clonfectin）试剂转染人胚肾细胞HEK293进行包装、扩增，获得高滴度的重组腺病毒；PCR法鉴定Adeno-p21，End-Point稀释法测定其滴度。同法创建对照组病毒Adeno-lacZ。48只大鼠随机分为4组：Ⅰ组（n=10）为空白对照组，仅做假手术处理；Ⅱ组（n=13）为模型对照组，通过套管法建立左向右分流型PH模型；Ⅲ组（n=14）为实验组，建立PH模型，并通过气管吸入法转染Adeno-p21重组腺病毒；Ⅳ组（n=11）为实验对照组，建立PH模型，并通过气管吸入法转染Adeno-lacZ重组腺病毒。16周后右心导管法测量各组大鼠右室平均压（mRVP）和肺动脉平均压（mPAP），计算右心室肥厚指数（RVHI）及RV／BW，评估p21对血流动力学的影响，HE染色观察小动脉结构、测量小动脉管径及管壁厚度计算WT％，Ⅲ、Ⅳ组Western blot法鉴定p21基因产物在肺组织中的表达。采用免疫组织化学方法研究肺动脉平滑肌细胞PCNA的表达，并通过原位缺口末端标记方法（TUNEL）检测大鼠肺动脉平滑肌细胞的凋亡，分别计算增殖指数（PⅠ）、凋亡指数（AⅠ）及PⅠ／AⅠ。结果1．PCR法从构建重组的腺病毒中扩增出腺病毒（370bp）及p21（489bp）的特异性片断，表明获得所需的携带目的基因的重组腺病毒，稀释法测得Adeno-p21和Adeno-lacZ的感染滴度分别是2×108pfu／L和1.2×108pfu／L。2．Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组的mRVP、mPAP及WT％均明显高于Ⅰ组（P＜0.05），Ⅱ、Ⅳ组RVHI明显高于Ⅰ组（P＜0.05）；与Ⅱ组相比，Ⅲ组的mPAP、mPVP、RVHI及WT％明显降低（P＜0.05），但与Ⅰ组相比，Ⅲ组的mPAP、mPVP及WT％仍明显高于Ⅰ组（P＜0.05）；与Ⅳ组相比，Ⅲ组的各项指标均低于Ⅳ组（P＜0.05）。HE染色标本上可见，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组肺动脉肌层及内膜均有不同程度的增厚以及肺小动脉肌化管腔狭窄；而Ⅰ组血管内膜光滑，内皮细胞连续，管壁薄，厚度均匀一致。3．Western blot结果示Ⅲ组出现21kd的特异性条带，提示目的基因已成功表达功能蛋白。4．转染p21基因的Ⅲ组，PⅠ明显低于Ⅱ组与Ⅳ组（P＜0.05），AⅠ明显增高，高于其他三组（P＜0.05），PⅠ／AⅠ明显低于Ⅱ组与Ⅳ组（P＜0.05）。结论1．5型腺病毒可成功携带人p21基因通过气管吸入法转染入左向右分流肺动脉高压动物模型体内并呈高表达。2．本实验p21基因可在一定程度上抑制大鼠左向右分流型肺动脉高压的发展，其机制可能在于p21基因可以诱导肺动脉平滑肌细胞凋亡增加。