论文摘要
背景先天性心脏病（congenital heart disease , CHD）简称先心病,是小儿时期最常见的心血管畸形,是人类最常见的出生缺陷。随着影像学和外科与介入手段的不断发展,对先心病的诊断和治疗有了很大进步,但对其发病机制了解甚少,多集中在心脏发育相关基因研究方面。心脏发育是一个极其复杂的过程,它涉及胚胎发育过程中众多基因在不同时间和空间上的顺序精确表达,并受多种转录因子调控[1]。该过程的实现并不是只由基因序列所决定,很大程度上由染色质构象改变所决定[2]。这种染色质构象改变又叫作染色质重塑（chromatin remodeling）,属于表观遗传学（epigenetic）研究范畴[3],而目前关于心脏发育表观遗传学机制研究甚少,那么在调控基因表达层面上,从表观遗传学的全新角度认识心脏发育机制具有重大科学意义。表观遗传学包括DNA修饰、组蛋白修饰和非编码RNA调控[4]三个层面。近年来研究发现组蛋白乙酰化修饰在胚胎发育中起重要调控作用。组蛋白乙酰化酶（histone acetyltransferases, HATs）是催化组蛋白引起乙酰化修饰的酶,决定心肌组织中组蛋白乙酰化修饰水平,从而影响心脏发育基因的时序表达调控。因此,要阐明心脏发育的表观遗传调控模式,需从研究发育心脏中HATs的时空表达变化入手。目的本研究通过检测与心脏有关的5种HATs亚型—p300、CBP、GCN5、PCAF和SRC1在发育心脏中的时空表达变化,建立胚胎心脏发育过程中不同HATs亚型时间剂量曲线,初步探讨各HATs亚型与心脏发生发育的关系。材料与方法选取胎龄7.518天、出生1天和3月成年昆明小鼠正常心脏,通过大体观察和石蜡切片HE染色技术详细描述心脏发育的形态学变化;利用免疫组织化学法和RT-PCR技术动态检测p300、CBP和GCN5在心脏发育过程中的蛋白表达分布和mRNA时序性表达变化;采用免疫组织化学法和Western blot技术动态分析PCAF和SRC1在小鼠心脏发育过程中的蛋白表达时空变化规律,建立心脏发育过程中不同HATs亚型的时间剂量曲线。结果1.小鼠胚胎（embryo E）7.5天出现新月形心脏原基,E8.5E9.5出现原始心管并环化, E10.5房室管形成并出现心内膜垫和突入心室腔的小梁,E11.5E13.5房间隔形成,E11.5E14.5室间隔形成,E12.5E15.5房室瓣形成,E11.5E13.5流出道被分割为主动脉和肺动脉,E11.5E16.5心肌细胞分化增殖使心壁致密变厚,E16.5生后1天心肌细胞增殖增大使心壁更厚且心脏体积增大明显,生后心脏随小鼠生长而增大,心肌细胞不再增殖。心肌细胞在胚胎时期为多边形,生后一周内逐渐过渡到成年时期的短柱状。2. p300和CBP在心脏发育过程中的时空表达变化:（1）免疫组织化学结果显示:p300在心脏发育整个时期心脏各部分均有很强或较强表达。而CBP在E7.5不表达;E8.5E9.5的心管中较强表达;E10.5E16.5及E18和生后1天仔鼠期心肌组织较强表达,房室瓣和小梁网弱表达,室间隔肌部较弱表达而膜部表达更弱;3月成年鼠心肌和小梁较弱表达,室间隔极弱表达。与同期同心脏区域的p300相比,CBP有相对低的阳性细胞表达率,差异有统计学意义（P<0.05）;（2）RT-PCR结果显示:E10.5天以后的发育心脏中,p300 mRNA在E10.5E11.5出现高峰表达,CBP mRNA在E10.5E12.5出现高峰表达,在随后的心脏发育时间点,二者表达呈逐渐下降趋势。3. GCN5在心脏发育过程中的时空表达变化:（1）免疫组织化学结果显示:GCN5在E7.5E9.5心脏原基中不表达;E10.5E11.5发育心脏中广泛弱表达,心内膜垫相对强表达;E12.5后发育时期心内膜垫及其发育形成的室间隔膜部和房室瓣相对强表达,心肌组织弱表达。（2）RT-PCR结果显示:E10.5天以后的发育心脏中,GCN5 mRNA在E10.5E11.5出现高峰表达, E12.5E15.5表达水平下降,E16.5至成年鼠期表达极低。4. PCAF在心脏发育过程中的时空表达变化:（1）免疫组织化学结果显示:PCAF在E7.5E9.5的心脏原基中广泛弱表达;E10.5生后1天新生鼠期心肌膜较强表达,心内膜、房室瓣和小梁网较弱表达,室间隔肌部弱表达,室间隔膜部极弱表达;3月成年鼠心肌和小梁弱表达,间隔极弱表达。（2）Western blot结果显示:E10.5天以后的发育心脏中,PCAF蛋白在E10.5已有相对高表达,E11.5达到表达高峰,此后表达逐渐降低,在E13.5E15.5和E16.5生后1天仔鼠期出现两个表达平台期,在成年鼠期心脏中表达最低。5. SRC1在心脏发育过程中的时空表达变化:（1）免疫组织化学结果显示:SRC1在E7.5心脏原基中不表达;E8.5E9.5的心管中微弱表达;E10.5后心脏发育各个阶段,小梁弱表达,心脏其它所有区域均较强而广泛表达。（2）Western blot结果显示: E10.5天以后的发育心脏中, SRC1蛋白在E10.5表达较低,E11.5E12.5达到表达高峰,此后表达下降并持续低表达至成年鼠期。结论HATs亚型p300、CBP、GCN5、PCAF和SRC1在发育心脏中存在不同的表达分布和变化规律,表明这些HATs亚型均参与了心脏的发生发育过程,且不同HATs亚型可能与心脏特定结构发育密切相关。
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