论文摘要
一、研究背景和目的应激为机体在各种内外环境因素及社会、心理因素刺激时所出现的全身性非特异性适应反应。军事应激是指军人在完成军事任务过程中对极端恶劣生存环境、精神超负荷紧张及超强度作业等在内的多种因素反应过程,包括心理、生理上的变化。适度应激反应往往能活化思维、提高军人的警觉性和作业效率,但当应激压力导致军人的认知、情绪和行为发生改变、严重降低作业效率时,则表现为军事应激障碍。心脏是应激作用的主要靶器官之一。研究发现多种心脏疾病的发生和发展与应激机制的激活密切相关,神经体液因素特别是炎症细胞因子的释放是重要机制。Toll样受体是一种膜受体,在机体防感染免疫中起关键作用,能被机体“危险”信号如:应激、损伤、坏死等激活。在心脏中主要表达TLR4。TLR4激活使得信号转导到胞内,在一系列酶的作用下,NF-κB活化,转入细胞核中诱导特定基因的表达,导致炎症因子产生。TLR4/NF-κB通路在慢性应激心脏中的作用还不清楚。为搞清上述问题,本课题建立了大鼠慢性应激模型,观察慢性应激对心肌的影响,研究TLR4/NF-κB、IL-6、TNF-α等和心肌损伤的关系,希望探索TLR4/NF-κB在慢性应激心脏中的作用,为慢性应激致心肌损伤防治提供实验依据。二、材料和方法:第一部分:军事训练应激对战士心血管系统影响的观察选取连队健康男性战士64人,年龄18-20岁,同时选取健康男战士10名做对照。军事训练应激为3公里越野加5分钟数学运算,军事训练前后检测BP、HR、EKG和SCL-90量表,并于训练后抽血查血常规、C-RP、心肌酶谱、ACTH、皮质醇、TNF-α、IL-6。对照组只抽血,不参加军事训练。第二部分:大鼠慢性应激致心肌损伤及NAC防治作用研究选用雄性SD大鼠,6-7周龄,体重180-220g,动物随机分为对照组和实验组,实验组又分为应激1d、1w、2w、3w、4w、NAC组,每组8只。实验组采用每天束缚6h+强迫游泳15min应激模式,NAC组在应激同时每日给予NAC150mg/kg灌胃,持续2周。实验期间每3天称1次体重,每天观察大鼠行为变化。各组于试验结束次日处死大鼠。处死前连续记录5分钟心率、EKG变化,记录血压变化。分离血清,同时留取心尖部心肌标本做TLR4 mRNA、NF-κB、电镜、病理和心肌匀浆等检查。对照组不应激,和实验组大鼠同时处死取材。心肌酶CK测定采用ABC-ELISA方法,LDH、AST用全自动生化分析仪自动检测。HE染色观察病理形态变化,同时根据心肌出血、水肿和渗出情况对心肌损伤进行评分,透射电镜观察心肌超微结构变化。采用Tunel法观察心肌细胞凋亡情况,用免疫组化方法观察心肌组织iNOS表达。第三部分:TLR4信号通路在慢性应激大鼠心肌表达和意义的研究实验动物及分组同第二部分。用RT-PCR方法测定心肌TLR4mRNA表达,用EMSA方法测定心肌NF-κB活性,用ELISA方法测定心肌匀浆TNF-α、IL-6含量,用免疫组化方法观察心肌组织TNF-α、IL-6表达。统计方法所有数据均用平均数±标准差表示,样本均数比较用t检验,组间比较用单因素方差分析,P <0.05认为有统计意义。三、结果:第一部分:急性军事训练前后对比,应激后战士HR（次/分）增快（82.17±15.38 vs 69.70±10.19, P<0.01）,DBP（mmHg）（78.90±8.40 vs74.68±8.68, P<0.01）升高。C-RP（mg/L）和对照组比较升高（2.05±9.36 vs 1.56±0.95,P<0.05）。6名战士EKG表现为窦性心动过速,1名表现为频发房性早搏、短阵二联律,1名表现为ST段抬高,其中V1导联>0.2mV。SCL-90量表9项分数每项和训练前比,均无显著性差异。训练后血浆ACTH、皮质醇、心肌酶谱、HB、HCT、WBC、TNF-α、IL-6等和对照组相比,无显著性差异。第二部分:1、建立了“束缚+强迫游泳”慢性应激大鼠模型。应激大鼠出现明显行为变化,体重增长明显减慢,血清皮质酮含量（nmol/L）从应激2周开始逐渐升高,应激2、3、4周和对照组比较差异有显著性（80.35±15.63,88.64±13.21,85.68±26.38 vs 63.04±9.91, P<0.05,P<0.05,P<0.05）。2、应激大鼠EKG变化:在应激1天组观察到3例室上性心动过速,4周组观察到1例室上性心动过速,在应激3、4周组,各观察到1例室性早搏,在NAC组观察到1例房颤。3、慢性应激大鼠心肌酶学和病理、超微结构变化和对照组比较,血浆CK（u/L）在应激1天组（595.51±53.78 vs 466.95±83.19,P<0.05）和1周组（574.61±50.33 vs 466.95±83.19, P<0.05）明显升高,血浆LDH（u/L）在应激1周组明显升高（4132.67±716.99 vs 1616.80±672.99, P<0.01）,血浆AST（u/L）在应激1天组（370.5±125.02 vs131.6±36.24,P<0.01）和1周组明显升高（260.40±98.77 vs 131.6±36.24, P<0.01）。病理结果显示:应激后大鼠心肌HE染色表现为心肌浊肿,间质血管扩张充血,心内膜下部分区域水肿,部分心内膜及瓣膜黏液变性,以应激1、2、3周组表现明显。应激2周组心肌损伤总评分较对照组明显增高（7.3±1.6 vs 2.7±0.5, p<0.01）。电镜结果显示:内皮细胞变性,心肌细胞、内皮细胞核浓缩,心肌细胞水肿,细胞外基质成分溶解消失,胞质、线粒体肿胀,内皮下结缔组织增厚,可见脂质沉积。以应激3、4周组表现明显。4、应激1d、1w、2w、3w、4w周组心肌细胞凋亡数和对照组比较明显增加,差异有显著性（ 27.13%±5.12%, 34.82%±7.98%, 31.51%±15.31%, 21.15%±2.60%, 25.83%±3.77% vs 10.31%±2.01%。P<0.01, P<0.01, P<0.01, P<0.05, P<0.01）,应激各组心肌均有iNOS表达,以1-3周最明显。5、NAC干预后,应激心肌心内膜病理改变明显减轻,水肿减轻,渗出减少,NAC治疗组心肌损伤评分总分较2周应激组明显减低（4.2±0.5vs7.3±1.6,P <0.01）,但仍高于对照组（4.2±0.5vs2.7±0.5, P <0.01）。NAC组心肌细胞凋亡明显减少,和2周应激组比较,差异有显著性（16.01%±2.66% vs 31.51%±15.31% , P<0.05）, NAC组心肌细胞iNOS表达也较2周应激组减少。第三部分:1、应激大鼠心肌TIR4mRNA表达增高。TLR4表达在应激1周组升高,持续到3周组,4周组降到正常水平,1-3周组表达情况和对照组相比,差异有显著性（1.15±0.30,1.10±0.19,1.18±0.29 vs 0.88±0.10。P<0.05,P<0.05,P<0.05）。应激大鼠心肌NF-κB活性增强。NF-κB活性在应激1天组增高,应激1周组降低,,应激2周组又升高,此后逐渐下降, 4周组下降到正常水平。应激1天组、2周组（7.75×105±3.31×105,6.96×105±3.08×105）和对照组（2.65×105±1.47×105）相比差异有显著意义（P<0.01,P<0.01）。应激大鼠心肌TNF-α和IL-6含量增高,表达增强。心肌匀浆IL-6和TNF-a水平在慢性应激后逐渐升高,至4周达高峰,和对照组相比,4周组IL-6（pg/g protein）（2174.28±742.14 vs 1285.14±462.4,P<0.05）和TNF-a（ng/g protein）（6.69±1.90 vs 3.80±2.35, P<0.05）水平均升高。免疫组化显示应激各组心肌胞浆中均可见TNF-a和IL-6表达。2、NAC治疗组NF-κB活性和应激2周组比较有明显降低,心肌匀浆IL-6（pg/g protein）（801.42±115.58 vs 1835.95±834.95, P<0.01）和TNF-a（ng/g protein）（1.30±0.60 vs 5.48±1.88, P<0.01）水平较应激组明显降低。四、结论1、军事训练急性应激后战士出现了心率增快、舒张压升高等表现,C-RP升高,部分战士EKG出现了窦性心动过速、频发房性早搏、ST段抬高等表现。说明军事训练后可以出现心血管方面的改变。2、成功建立了大鼠“束缚+强迫游泳”慢性应激模型。应激大鼠皮质酮含量从应激后2周开始升高,出现了明显的焦虑、倦怠、反应低下、食欲减少、体重增长减慢等变化。3、慢性应激大鼠血浆心肌酶升高,心肌病理和超微结构出现了改变,心肌细胞凋亡增加,部分大鼠出现了室上性心动过速、室性早博、房颤等心律失常表现,表明慢性应激可导致大鼠心肌损伤。4、慢性应激大鼠心肌TLR4表达增高,NF-κB活性增强,心肌IL-6、TNF-α含量和表达增高。应用NAC可抑制NF-kB的活性和IL-6、TNF-α的表达,减轻心肌损伤。说明TLR4/NF-κB信号通路的激活可能是慢性应激心肌损伤的重要机制,并可能是防治慢性应激致心肌损伤的新的靶点。