东方拟无枝酸菌产聚乳酸降解酶和蛋白酶的研究

论文摘要

随着世界社会经济的发展,由石油等化石资源合成的高分子化合物制品的大量生产、消费及遗弃等所引起的环保问题日趋严重,人们的环境保护意识日趋强烈。为了解决合成树脂和纤维不易被环境分解的问题,生物可降解高分子材料逐渐成为研究的热点,其中聚乳酸被认为是一种最有前途的可降解高分子化合物。与聚乳酸的合成相比,有关其生物降解的研究却相对滞后。PLA在自然界中降解缓慢,已发现的降解微生物及所产降解酶数量种类有限,且具有一定的特殊性,这在一定程度上制约了PLA生物降解机理的阐明,也限制了可控降解材料的开发推广和应用。本论文的主要工作是从自然环境中筛选得到了一株可以高效降解聚乳酸的菌株。经过菌种鉴定,确定此菌株为放线菌属的东方拟无枝酸菌。研究了不同的诱导物对于该菌产聚乳酸降解酶活性的影响,得出明胶为最佳的诱导物之一。由于明胶也是该菌产生蛋白酶的诱导物,在诱导培养65小时后,其蛋白酶产生量达到最高值,发酵液中蛋白酶活最高可达29,000U/L。虽然蛋白酶酶活和聚乳酸降解酶酶活最高峰出现的时间稍有不同,但两者活性均随诱导时间而增加,说明蛋白酶活性和聚乳酸降解酶活性的产生具有一定的相关性;同时,对发酵粗酶液的基本酶学性质进行了研究,诱导酶系表现出的蛋白酶活性和聚乳酸降解酶活性,均在碱性pH范围内具有较高的活性和稳定性,从而显示聚乳酸降解活性与蛋白酶活性间存在某种内在的联系。进一步对菌株的胞外酶系进行了分析,纯化得到了五个蛋白酶组分,其中三个具有聚乳酸降解活性,分别为PLAaseⅠPLAaseⅡ和PLAaseⅢ。对粗酶液的以及聚乳酸降解酶组分的底物特异性研究表明,并不是所有的蛋白酶都具有聚乳酸降解酶活性。但从一株菌株当中可以同时分离出三种聚乳酸降解酶组分,说明东方拟无枝酸菌中所产生的聚乳酸降解酶在酶性质上可能存在某种内在联系。探讨了聚乳酸酶解产物的分析方法,从而为进一步研究聚乳酸的酶学降解机制提供分析技术平台。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩写词表
• 第一章 研究工作背景
• 1.1 导言
• 1.2 聚乳酸结构，制备方法，物化性质和应用
• 1.2.1 聚乳酸的结构
• 1.2.2 聚乳酸的合成
• 1.2.3 聚乳酸的理化性质
• 1.2.4 聚乳酸的应用
• 1.3 聚乳酸的降解
• 1.3.1 聚乳酸降解菌株
• 1.3.2 聚乳酸降解酶类
• 1.4 蛋白酶与聚乳酸降解
• 1.4.1 蛋白酶研究的历史与现状
• 1.4.2 蛋白酶的分类
• 1.4.3 蛋白酶的应用
• 1.5 本论文研究的内容和意义
• 第二章 聚乳酸降解菌株的筛选
• 2.1 导言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 菌株来源
• 2.2.2 试剂
• 2.2.3 仪器
• 2.2.4 培养基和溶液
• 2.2.5 菌种筛选
• 2.2.6 菌株鉴定
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 高效降解PLA菌株的筛选
• 2.3.2 菌株鉴定结果
• 2.4 小结
• 第三章 PLA降解酶活性检测方法的建立
• 3.1 导言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌株
• 3.2.2 培养基
• 3.2.3 酶液制备
• 3.2.4 PLA乳化底物的制备
• 3.2.5 酶活检测方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.4 小结
• 第四章 东方拟无枝酸菌产蛋白酶及PLA降解酶条件的初步研究
• 4.1 导言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 菌株
• 4.2.2 仪器
• 4.2.3 培养基和溶液
• 4.2.4 酶活的测定
• 4.2.5 生物量测定
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 菌株Amycolatopsis orientalis的产酶条件
• 4.3.2 菌株Amycolatopsis orientalis的产酶进程
• 4.4 小结
• 第五章 菌株Amycolatopsis orientalis胞外酶系的性质研究
• 5.1 导言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 材料
• 5.2.2 仪器
• 5.2.3 主要试剂
• 5.2.4 菌株胞外粗酶液制备
• 5.2.5 酶活测定
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 Amycolatopsis orientalis诱导粗酶液基本性质
• 5.3.2 聚乳酸降解酶与蛋白酶组分的分离
• 5.3.3 酶组分底物特异性
• 5.4 小结
• 第六章 聚乳酸酶解产物分析方法初探
• 6.1 导言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 酶与底物
• 6.2.2 主要仪器和试剂
• 6.2.3 聚乳酸降解产物制备
• 6.3 PLA酶学降解产物的HPLC和TLC分析
• 6.3.1 有机酸标准样品的HPLC分析
• 6.3.2 PLA乳化液和乳化剂的HPLC分析
• 6.3.3 PLAase组分和PLA乳化液作用后的产物HPLC分析
• 6.3.4 PLA酶学降解产物的TLC分析
• 6.4 小结
• 参考文献
• 致谢
• 学位论文评阅及答辩情况表