论文摘要
目的自1879年,Ringer在台湾从一具葡萄牙水手尸体肺脏内首次检出并殖吸虫,至今人类研究已经有120多年的历史。并殖吸虫种类很多,世界各地报道达50多种（含种、亚种、变种和同种异名等）,广泛分布于东亚、东南亚、非洲和拉丁美洲等国家,在我国并殖吸虫报道有30种之多（含种、亚种、变种和同种异名等）,分布于全国各地,尤其在江南、西南和东北各省山区等地。并殖吸虫种类命名存在如同种异名、种名错定等诸多问题,主要与60年代以前单一以传统形态学为依据和6080年代并殖吸虫分类研究中的一点浮躁表现有关。因此澄清并殖吸虫的分类学地位,不仅对充实与修订并殖吸虫分类学有理论意义,而且尚可为并殖吸虫的临床医学、免疫学和流行病学监控与制定防治策略提供参考。90年代以来,分子生物学技术广泛应用于物种的遗传变异和分类,直接从DNA水平反映基因本身,具有优越性。因此,传统分类学结合现代分子生物学方法分类是目前被普遍接受的一种分类方式。本实验结合形态学观察和RAPD技术对我国湖北、江西、浙江等地的11株并殖吸虫进行研究,以了解其遗传变异情况,为并殖吸虫分类提供依据,尤其对湖北省并殖吸虫流行区划分提供分子生物学依据。此外,探讨采用不同虫期标本（成虫和囊蚴）及其不同保存方法（10%福尔马林或-20℃冷藏）对该研究的影响。材料与方法收集我国湖北省咸宁市温泉区、江西省武宁县、浙江省绍兴兰亭乡、湖北省赤壁市赵李桥镇、湖北省十堰市区、湖北省五峰县、湖北省鹤峰县五里镇、湖北省鹤峰县走马镇、湖北省神农架林区3省9地的11株并殖吸虫。其中湖北省咸宁市温泉区、江西省武宁县、浙江省绍兴兰亭乡和湖北十堰市区4地的标本为成虫,依地名分别称:湖北温泉、江西武宁、浙江兰亭、湖北十堰;其余5地标本为囊蚴,其中在五峰县和鹤峰县走马镇的同一淡水蟹发现有大小两种囊蚴,依据大小分别称五峰（a）、五峰（b）、走马（a）、走马（b）,余3株依地名分别称:湖北赤壁、湖北五里、湖北神农架。1.外形观察:肉眼观察成虫外形,体视显微镜观察囊蚴的形态并作记录;2. DNA提取:采取不同方法提取不同标本基因组DNA;3.RAPD-PCR技术:分别扩增上述并殖吸虫的基因组DNA,根据扩增的结果,计算各株并殖吸虫间的遗传距离和相似系数,并采用SPSS11.0软件的Between-groups linkage法对所得二元数据进行聚类分析,绘制系统进化树。结果1.外形观察:成虫湖北十堰株呈长梭形,湖北温泉、江西武宁和浙江兰亭等3株呈椭圆形;囊蚴呈圆形或类圆形,囊壁两层,排泄囊内含黑色颗粒,鉴定为并殖吸虫囊蚴。其中湖北赤壁株内壁较厚;五峰（a）、五峰（b）、走马（a）、走马（b）和五里等5株内壁较薄;湖北神农架株,囊蚴形态因故已有些变形,但可以确定为并殖吸虫囊蚴。2.DNA提取:DNA溶液A260/A280值经测定在1.60～2.00之间,纯度符合要求。3.RAPD-PCR:①各株间差异湖北温泉、江西武宁、浙江兰亭和湖北赤壁4株遗传距离在0.1034～0.1930;湖北走马（a）、湖北走马（b）、湖北五峰（a）、湖北五峰（b）、湖北十堰和湖北五里等鄂西6株遗传距离在0.1233～0.3000,其中湖北走马2株扩增带型具有较大相似性,相似系数为0.8182,遗传距离为0.1818,湖北五峰2株扩增带型也具有较大相似性,相似系数0.8767,遗传距离仅为0.1233。湖北神农架株与各株遗传距离在0.2329～0.4154,其与湖北温泉、江西武宁、浙江兰亭和湖北赤壁4株遗传距离在0.3333～0.4154,与余6株遗传距离在0.2329～0.3731。②系统进化树在SPSS构建的系统进化树中11株并殖吸虫分为3类:江西武宁、浙江兰亭、湖北温泉和湖北赤壁等株为一类;湖北走马（a）、湖北走马（b）、湖北五峰（a）、湖北五峰（b）、湖北十堰和湖北五里等株为一类;湖北神农架株为另一类。4.湖北省主要有两个并殖吸虫流行区:以卫氏并殖吸虫为主的鄂东南区;以斯氏并殖吸虫为主的鄂西区。结论1.根据RAPD-PCR的实验结果,3省11株并殖吸虫在基因水平分为3类:①江西武宁、浙江兰亭、湖北温泉和湖北赤壁;②湖北走马（a）、湖北走马（b）、湖北五峰（a）、湖北五峰（b）、湖北十堰和湖北五里;③湖北神农架。2.湖北省存在以卫氏并殖吸虫为主的鄂东南和以斯氏并殖吸虫为主的鄂西两个流行区。3.采用不同虫期（成虫和囊蚴）标本及其不同保存方法（10%福尔马林或-20℃冷藏）不影响遗传变异研究的结果。