基于胆碱能抗炎通路的艾灸治疗实验性RA作用机制研究

论文摘要

目的：本研究依据“艾灸治疗RA抗炎效应明确,胆碱能抗炎通路对全身和局部炎症均具有明显的抑制作用”的基本事实,以针灸理论为指导,艾灸家兔“肾俞”、“足三里”治疗实验性RA,围绕滑膜炎症关键病理环节,选择胆碱能抗炎通路作为研究切入点,以“艾灸刺激一胆碱能抗炎通路一抗炎效应”为研究主线,运用神经阻断、免疫组化、实时荧光定量PCR等方法技术,探索胆碱能抗炎通路在艾灸治疗RA抗炎效应中的作用机制,对于深化艾灸治疗RA的原理研究、丰富灸法的科学内涵具有重要的价值和意义。方法：将日本大耳白兔随机分为正常对照组、RA模型组、艾灸治疗组、艾灸治疗迷走神经切断组、艾灸治疗假手术组,用福氏完全佐剂塑造RA疾病模型,运用颈部左侧迷走神经干切断术作为干预手段,艾灸“肾俞”、“足三里”治疗。1.观察RA家兔的整体状况、体重、膝关节周长、滑膜组织炎症病理形态；2.采用Elisa法检测滑膜液中TNF-α、IL-1、IL-6、HMGB1含量；3.采用Elisa法检测血清中a7nAChR和ChAT的含量；分别采用免疫组化法和实时荧光定量PCR法检测滑膜组织中a7nAChR、ChAT的蛋白表达和mRNA表达。4.采用免疫组化法检测滑膜组织中NF-κBp65、NF-κBp50、IκBα、IKKβ的表达。结果：1.艾灸家兔“肾俞”、“足三里”可以明显改善RA家兔全身状况、膝关节肿胀、关节滑膜炎症病理变化,而在切断迷走神经的情况下其作用显著降低。2.滑膜液中细胞因子检测结果显示：模型组与正常对照组相比较,RA模型组关节滑膜液中TNFα、IL-1、IL-6、HMGB1含量显著增高（P<0.01）；与RA模型组比较,艾灸治疗组、艾灸治疗假手术组关节滑膜液中TNFα、IL-1、IL-6、 HMGB1含量显著降低（P<0.01）,而艾灸治疗迷走神经切断组无明显降低(（P>0.05）；与艾灸治疗组比较,艾灸治疗迷走神经切断组滑膜液中TNFα、IL-1、 IL-6、HMGB1含量显著增高（P<0.01）,但艾灸治疗假手术组无明显增高（P>0.05）。3.α7nAChR、ChAT表达结果显示：模型组与正常对照组相比较,模型组血清中α7nAChR、ChAT含量、滑膜组织中α7nAChR、ChAT蛋白表达和mRNA表达均显著降低（P<0.01）；与模型组比较,艾灸组和假手术组血清中α7nAChR、 ChAT含量、滑膜组织中α7nAChR、ChAT蛋白表达和mRNA表达均显著增高（P<0.01）,而艾灸治疗迷走神经切断组无明显增高（P>0.05）；与艾灸组比较,艾灸治疗迷走神经切断组血清中α7nAChR、ChAT含量、滑膜组织中α7nAChR、ChAT蛋白表达和mRNA表达均显著降低（P<0.01）,但假手术组无明显降低（P>0.05）。4.①NF-κBp65、NF-κBp50、p-IκBα、IKKβ表达结果显示：模型组与正常对照组相比较,模型组滑膜组织中NF-κBp65、NF-κBp50、p-IκBα、IKKβ的表达显著增高（P<0.01）；与模型组比较,艾灸组和假手术组滑膜组织中NF-κBp65、 NF-KBp50、p-IκBα、IKKβ的表达显著降低（P<0.01）,而艾灸治疗迷走神经切断组无明显降低（P>0.05）；与艾灸组比较,艾灸治疗迷走神经切断组滑膜组织中NF-KBp65、NF-κBp50、p-IKBα、IKKβ的表达显著增高（P<0.01）,但假手术组无明显增高（P>0.05）。②IκBα表达结果显示：模型组与正常对照组相比较,模型组滑膜组织中IκBα的表达显著降低（P<0.01）；与模型组比较,艾灸组和假手术组滑膜组织中IκBα的表达显著增高（P<0.01）,而艾灸治疗迷走神经切断组无明显增高（P>0.05）；与艾灸组比较,艾灸治疗迷走神经切断组滑膜组织中IκBα的表达显著降低（P<0.01）,但假手术组无明显降低（P>0.05）。结论：1.艾灸家兔“肾俞”、“足三里”可以明显改善实验性RA家兔全身状况、膝关节肿胀、关节滑膜炎症病理变化,表明艾灸具有明确的抗炎消肿、抑制滑膜炎症作用,而在切断迷走神经的情况下其抗炎作用显著降低,提示艾灸治疗RA的抗炎效应可能与兴奋胆碱能抗炎通路密切相关。2.艾灸家兔“肾俞”、“足三里”可以抑制实验性RA家兔滑膜液中细胞因子TNF-α、IL-1、IL-6和HMGB1水平,但在切断迷走神经的情况下其作用显著下降,提示兴奋胆碱能抗炎通路可能是艾灸抑制实验性RA家兔滑膜细胞分泌促炎细胞因子的重要机制之一。3.艾灸家兔“肾俞”、“足三里”可以上调ChAT在RA家兔外周血和滑膜组织中的表达,激活免疫系统的固有胆碱能系统,但在切断迷走神经的情况下其作用显著降低,提示艾灸可能通过兴奋迷走神经释放ACh,并与免疫细胞表面的a7nAChR结合,从而激活免疫细胞的固有胆碱能系统,转化为免疫系统内弥散的、持续的免疫调节。4.艾灸家兔“肾俞”、“足三里”可以抑制RA家兔滑膜组织中NF-κBp65、 NF-κBp50、p-IκBα、IKKβ的蛋白表达,上调IκBα的蛋白表达,但在切断迷走神经的情况下其作用显著降低,因此推测艾灸可能通过抑制IKK/IκB/NF-κB信号转导通路活化,改善RA家兔滑膜NF-κB的高调控状态,抑制滑膜细胞炎性细胞因子和炎性介质的合成和分泌,从而实现其抗炎效应,胆碱能抗炎通路在其中具有重要作用。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 目录
• 中英文缩略词表
• 引言
• 第一部分 切断迷走神经对艾灸治疗实验性RA家兔抗炎效应的影响
• 1 实验材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 主要试剂
• 1.3 实验药品
• 1.4 主要仪器
• 1.5 主要试剂的配置
• 2 实验方法
• 2.1 动物分组
• 2.2 颈迷走神经干切断术
• 2.3 RA模型塑造
• 2.4 艾灸治疗方法
• 2.5 滑膜组织取样
• 2.6 检测指标方法
• 2.6.1 一般情况观察
• 2.6.2 膝关节周长测定
• 2.6.3 滑膜组织形态学检测
• 2.7 统计处理方法
• 3 实验结果与分析
• 3.1 动物一般情况比较
• 3.2 各组家兔体重增长情况
• 3.3 艾灸对实验性RA家兔膝关节周长的影响
• 3.3.1 各组家兔右膝关节周长的比较
• 3.3.2 各组家兔左膝关节周长的比较
• 3.4 艾灸对实验性RA家兔关节滑膜病理形态的影响
• 3.4.1 光镜下滑膜组织病理形态
• 3.4.2 光镜下滑膜组织病变程度与积分
• 第二部分 切断迷走神经对艾灸调控实验性RA家兔滑膜细胞分泌功能的影响
• 1 实验材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 2 实验方法
• 2.1 动物分组及处理
• 2.2 滑膜液的取样
• 2.3 指标检测方法
• 2.3.1 各组家兔滑膜液中TNF-α含量的检测
• 2.3.2 各组家兔滑膜液中IL-1含量的检测
• 2.3.3 各组家兔滑膜液中IL-6含量的检测
• 2.3.4 各组家兔滑膜液中HMGB1含量的检测
• 2.4 统计处理方法
• 3 实验结果与分析
• 3.1 艾灸对实验性RA家兔关节滑膜液TNF-α含量的影响
• 3.2 艾灸对实验性RA家兔关节滑膜液IL-1含量的影响
• 3.3 艾灸对实验性RA家兔关节滑膜液IL-6含量的影响
• 3.4 艾灸对实验性RA家兔关节滑膜液HMGB1含量的影响
• 第三部分 艾灸对实验性RA家兔胆碱能神经功能及相关受体的影响
• 1 实验材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 2 实验方法
• 2.0 动物分组及处理
• 2.1 血清的取样
• 2.2 滑膜组织取样
• 2.3 指标检测方法
• 2.3.1 各组家兔血清中α7nAChR、ChAT含量的检测
• 2.3.2 各组家兔滑膜组织中α7nAChR、ChAT蛋白表达的检测
• 2.3.3 各组家兔滑膜组织中α7nAChRmRNA和ChATmRNA表达水平检测
• 2.3.3.1 组织总RNA的抽提
• 2.3.3.2 组织总RNA的鉴定与评估
• 2.3.3.3 RNA逆转录合成cDNA
• 2.3.3.4 引物设计
• 2.3.3.5 实时荧光定量聚合酶链式反应
• 2.3.3.6 实时荧光定量PCR反应结果分析
• 2.4 统计处理方法
• 3 实验结果与分析
• 3.1 艾灸对实验性RA家兔血清中α7nAChR含量的影响
• 3.2 艾灸对实验性RA家兔血清中ChAT含量的影响
• 3.3 艾灸对实验性RA家兔滑膜组织α7nAChR蛋白表达的影响
• 3.4 艾灸对实验性RA家兔滑膜组织中ChAT蛋白表达的影响
• 3.5 艾灸对实验性RA家兔滑膜组织α7nAChRmRNA表达水平的影响
• 3.5.1 滑膜组织α7nAChRmRNART-PCR扩增曲线及熔解曲线分析
• 3.5.2 滑膜组织α7nAChRmRNA表达水平
• 3.6 艾灸对实验性RA家兔滑膜组织ChATmRNA表达水平的影响
• 3.6.1 滑膜组织ChATmRNA RT-PCR扩增曲线及熔解曲线分析
• 3.6.2 滑膜组织ChATmRNA表达水平
• 第四部分 切断迷走神经对艾灸调控实验性RA家兔滑膜细胞NF-κB信号通路的影响
• 1 实验材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 2 实验方法
• 2.1 动物分组及处理
• 2.2 滑膜组织的取样
• 2.3 指标检测方法
• 2.3.1 RA家兔滑膜组织中NF-κBp65蛋白表达的检测
• 2.3.2 RA家兔滑膜组织中NF-κBp50蛋白表达的检测
• 2.3.3 RA家兔滑膜组织中IκBα蛋白表达的检测
• 2.3.4 RA家兔滑膜组织中ρ-IκBα蛋白表达的检测
• 2.3.5 RA家兔滑膜组织中IKKβ蛋白表达的检测
• 2.4 免疫组化结果的图象分析
• 2.5 统计处理方法
• 3 实验结果与分析
• 3.1 艾灸对实验性RA家兔关节滑膜组织NF-κBp65表达的影响
• 3.2 艾灸对实验性RA家兔关节滑膜组织NF-κBp50表达的影响
• 3.3 艾灸对实验性RA家兔关节滑膜组织IκBα表达的影响
• 3.4 艾灸对实验性RA家兔关节滑膜组织ρ-IκBα表达的影响
• 3.5 艾灸对实验性RA家兔关节滑膜组织IKKβ表达的影响
• 讨论
• 1 中医对类风湿性关节炎的认识
• 1.1 中医对类风湿性关节炎病名的认识
• 1.2 中医对类风湿性关节炎病因病机的认识
• 1.2.1 正气亏虚,腠理空虚是痹证发生的根本内在因素
• 1.2.2 感受外邪是致痹的重要条件
• 1.2.3 “痰瘀凝结,经脉不通”是痹症发病的病理关键
• 2 现代医学对RA的认识
• 2.1 滑膜炎症
• 2.2 细胞因子
• 2.3 信号转导通路
• 3 胆碱能抗炎通路与炎症
• 3.1 胆碱能抗炎通路的炎症调节机制
• 3.2 胆碱能抗炎通路对炎症因子合成与释放的影响
• 3.3 胆碱能抗炎通路的信号转导
• 3.4 胆碱能抗炎通路调控炎症性疾病
• 4 动物模型的选择
• 5 灸法使用与穴位的选择
• 6 胆碱能抗炎通路在艾灸治疗实验性RA家兔抗炎效应中的作用
• 6.1 艾灸对实验性RA家兔整体状况及体重的影响
• 6.2 艾灸对实验性RA家兔膝关节周长的影响
• 6.3 艾灸对实验性RA家兔滑膜组织病理形态的影响
• 7 胆碱能抗炎通路在艾灸调控实验性RA家兔滑膜细胞分泌功能中的作用
• 7.1 艾灸对实验性RA家兔滑膜液TNF-α含量的影响及其意义
• 7.2 艾灸对实验性RA家兔滑膜液IL-1含量的影响及其意义
• 7.3 艾灸对实验性RA家兔滑膜液IL-6含量的影响及其意义
• 7.4 艾灸对实验性RA家兔滑膜液HMGB1含量的影响及其意义
• 8 艾灸对实验性RA家兔胆碱能神经功能及相关受体的影响
• 8.1 艾灸对实验性RA家兔血清及滑膜组织中α7nAChR表达的影响及其意义
• 8.2 艾灸对实验性RA家兔血清及滑膜组织中ChAT表达的影响及其意义
• 9 艾灸对实验性RA家兔滑膜细胞NF-κB信号通路的影响及其胆碱能神经的调控
• 9.1 艾灸对实验性RA家兔滑膜细胞NF-κBp65、NF-κBp50表达的影响及其胆碱能神经的调控
• 9.2 艾灸对实验性RA家兔滑膜细胞ρ-IκBα、IκBα含量的影响及其胆碱能神经的调控
• 9.3 艾灸对实验性RA家兔滑膜细胞IKKβ含量的影响及其胆碱能神经的调控
• 结论
• 本研究的创新点
• 问题与展望
• 致谢
• 参考文献
• 附件
• 附件1：综述
• 参考文献
• 附件2：附图
• 1. 颈左侧迷走神经干切断术
• 2. 兔滑膜组织病理图谱
• 3. 兔滑膜组织免疫组化图片
• 在读期间公开发表的学术论文、专著及科研成果