玉米干旱诱导基因的克隆及功能鉴定

论文摘要

干旱是影响玉米产量的重要的非生物胁迫因素，干旱等非生物胁迫能够诱导植物表达一些反应蛋白，这些蛋白在植物抗逆中起到重要作用。在本实验室构建的干旱盐碱共胁迫玉米全组织EST文库中，我们找到了一个干旱诱导基因片断，我们将其命名为RA33G4.用5`RACE的方法，我们获得RA33G4全长cDNA.RA33G4全长cDNA.含有478个碱基对，其ORF编码58个氨基酸，是一个含有两个跨膜区结构的小型蛋白。通过序列分析和相关文献，发现RA33G4属于一个高度保守的蛋白家族，该蛋白家族具有保持胁迫环境下的细胞结构的重要功能。 为了研究RA33G4基因在玉米抗旱过程中的作用，构建了RA33G4植物表达载体，将上述表达载体导入农杆菌并用于侵染玉米，使其在玉米中过量表达。经过PCR检测得到4株转基因玉米植株，定量PCR显示RA33G4在转基因玉米中表达量大量提高。对转基因株系进行5％的PEG浓度的模拟干旱胁迫，结果显示转基因苗较野生型植株萎焉度低，转基因植株显示出了明显的耐旱性，说明在玉米中大量表达RA33G4能提高玉米抗旱性。同时，我们建立了高效快速的玉米转化系统。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 一、前言
• 1.1 干旱对玉米的影响
• 1.1.1 玉米国内外的生产状况
• 1.1.2 干旱是制约玉米生产的主要因素之一
• 1.1.3 干旱对玉米的伤害
• 1.2 玉米的抗旱研究
• 1.2.1.玉米抗旱生理生化机制
• 1.2.2.玉米对干旱、盐、冷等胁迫的交叉反应
• 1.2.3 植物干旱诱导蛋白
• 1.2.4.玉米抗旱指标
• 1.3 玉米转基因研究
• 1.3.1.玉米再生体系
• 1.3.2 单子叶植物的遗传转化
• 1.3.3 玉米转基因研究进展
• 1.4 本研究工作的范围和意义
• 二、材料方法
• 2.1 本实验所用细菌菌株、培养基及其它溶液的种类与组成
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 培养基及其溶液的种类与组成
• 2.1.3 溶液的配制
• 2.1.4 本实验所用的玉米品种
• 2.2 基因克隆及分子操作
• 2.2.1 质粒的提取
• 2.2.2 感受态细菌的制备
• 2.2.3 质粒的热转化
• 2.2.4 用三亲结合的方法向农杆菌导入目的质粒
• 2.2.5 限制性内切酶反应与连接反应
• 2.2.6 玉米RNA的提取纯化
• 2.2.7 RA33G4全长cDNA的合成
• 2.2.8 引物设计
• 2.2.9 PCR反应
• 2.2.10 凝胶电泳
• 2.2.11 DNA片段浓度、大小测算
• 2.2.12 从凝胶中回收目的DNA片段
• 2.2.13 实时荧光定量PCR
• 2.3 玉米组织培养和转化
• 2.3.1 玉米生长调节剂的种类与配制
• 2.3.2 玉米种子的取材与消毒
• 2.3.3 丛生芽的诱导和植株再生
• 2.3.4 转基因玉米植株的获得
• 三 结果与分析
• 3.1 玉米RA33G4基因全长cDNA的克隆
• 3.1.1 制备玉米总RNA
• 3.1.2 RA33G4 5′端序列的克隆
• 3.1.3 RA33G4全长cDNA的序列及序列分析
• 3.2 RA33G4表达载体的构建
• 3.2.1 克隆RA33G4到pGEM-TEasy Vector
• 3.2.2 克隆RA33G4到pGSA 1252
• 3.2.3 将pGSA1252-RA33G4质粒导入农杆菌LBA4404菌株中
• 3.3 玉米再生体系的建立和遗传转化
• 3.3.1 丛生芽的诱导和再生
• 3.3.2 玉米的转化和筛选
• 3.3.3 转基因植株的分子鉴定和RA33G4基因表达分析
• 3.3.3.1 转基因植株的PCR检测
• 3.3.3.2 转基因株系RA33G4基因表达分析
• 3.4 转基因植株干旱抗性初步检测
• 四 讨论
• 4.1 RA33G4基因
• 4.2 建立良好的玉米基因转化受体系统
• 4.3 农杆菌的恰当使用对转化的影响
• 4.4 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文