姬松茸（Agaricus blazei Murill）提取物组分体外抗病毒和抗肿瘤活性研究

论文摘要

姬松茸(Agaricus blazei Murill)原产于美国、巴西等地,又名巴西蘑菇,其水溶液的酒精沉淀物中含有大量姬松茸多糖、糖蛋白复合物、甾醇类等物质,具有抗病毒、抗癌等生物学功能。姬松茸提取物组分具有绿色、低毒、应用后对人体毒副作用小等特点,为新型天然抗病毒、抗肿瘤药物的研究及制备提供了良好的材料。本文通过热水浸提、梯度酒精沉淀和真空冷冻干燥等方法,得到了5种姬松茸提取物组分(E1~5),成分分析实验证明蛋白和多糖是这5种组分的主要组成成分。利用大菱鲆鳍细胞(turbot fin cells,TF细胞)进行的5种组分的细胞毒性实验结果显示,5种姬松茸提取物组分在浓度低于1.0 mg/mL时,对TF细胞没有任何毒性,而浓度高于1.5 mg/mL时,细胞虽然透光性依然很好,但是开始收缩变圆,且细胞的形态改变同姬松茸提取物组分的浓度成正相关。通过5种姬松茸提取物组分对淋巴囊肿病毒(lymphocystis disease virus,LCDV)感染TF细胞的过程的影响来研究姬松茸提取物组分与LCDV的相互关系。结果显示:用5种姬松茸提取物组分,尤其是E5组分(1.0mg/mL)处理2 h后的LCDV感染TF细胞,能够明显抑制LCDV感染所导致的TF细胞病变程度。将LCDV和5种姬松茸提取物组分混合后感染TF细胞,也能明显抑制LCDV感染所引起的TF细胞病变,表明姬松茸提取物组分可能有直接灭活病毒和/或阻断病毒吸附细胞的作用。TF细胞经LCDV吸附4 h后再添加姬松茸提取物组分培养,细胞病变程度并不改变,表明5种姬松茸提取物组分对LCDV在TF细胞内的繁殖并无显著的抑制作用。为阐明姬松茸的抗肿瘤作用及机理,本文利用人宫颈癌细胞(human cervical carcinoma cell line,HeLa)、人肝癌细胞(human hepatocellularcarcinoma cell line,HepG2)、人胃癌细胞(human gastric carcinoma cell line,SGC),通过细胞计数,光学显微镜观察,琼脂糖凝胶电泳,透射电镜等方法,对所得的5种姬松茸提取物组分体外诱导3种肿瘤细胞凋亡的作用进行了研究。细胞计数结果显示,5种提取物组分对HeLa、HepG2、SGC细胞均有不同程度的抑制作用,E4组分的抑制3种肿瘤细胞增殖效果最好。添加E4组分,浓度为1.5mg/mL,培养HeLa、HepG2、SGC细胞72 h,抑制率分别为84.04%、77.79%、60.27%。HeLa、HepG2、SGC细胞经E4组分处理后出现核固缩、膜起泡、凋亡小体形成等现象,并且琼脂糖凝胶电泳结果显示典型梯状条带(DNA ladder)。然而,同样浓度的E4组分并不能诱导TF细胞和人角膜内皮细胞(human corneal endothelial,HCE)发生DNA片段化,表明姬松茸提取物具有细胞选择性毒性的特征。综上所述,本文利用热水浸提、酒精沉淀等方法得到了5种姬松茸提取物组分,并研究了它们在体外抗病毒感染以及诱导肿瘤细胞凋亡等方面的作用。为全面查清姬松茸提取物的体外抗病毒感染活性及其作用机理,进而为水产养殖鱼类高效抗淋巴囊肿病毒感染活性物质的开发和牙鲆淋巴囊肿病的防治奠定了基础,同时也为筛选出高效抗肿瘤活性的姬松茸提取物组分,为新型天然抗肿瘤药物的研究与开发创造了条件。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 姬松茸提取物及其生物活性的研究进展
• 1 姬松茸提取物活性成分简介
• 1.1 多糖
• 1.1.1 姬松茸子实体多糖
• 1.1.2 姬松茸菌丝体多糖
• 1.2 核糖核蛋白
• 1.3 外源凝集素
• 1.4 甾醇类
• 1.5 脂类
• 2 姬松茸活性物质的提取工艺概述
• 3 姬松茸提取物抗病毒活性的研究进展
• 3.1 病毒的致病机理
• 3.2 姬松茸提取物抗病毒活性的研究现状
• 3.3 姬松茸提取物抗病毒活性的作用机制
• 4 姬松茸提取物抗肿瘤活性的研究进展
• 4.1 生物多糖的抗肿瘤作用途径
• 4.1.1 直接抑制肿瘤生长
• 4.1.2 间接抗瘤机制
• 4.2 姬松茸提取物抗肿瘤活性的研究现状
• 4.2.1 抑制肿瘤细胞增殖
• 4.2.2 诱导肿瘤细胞凋亡
• 4.3 姬松茸提取物抗肿瘤活性的作用机制
• 5 姬松茸提取物的其它生物活性
• 6 研究目的
• 7 研究意义
• 第二章 姬松茸提取物组分制备、测定及其对细胞的毒性研究
• 1 材料及用品
• 1.1 实验材料
• 1.2 主要的实验仪器
• 1.3 实验药品
• 1.4 常用溶液配方
• 1.4.1 总糖含量测定溶液的配制
• 1.4.2 蛋白含量测定溶液的配制
• 1.4.3 MTT溶液的配制
• 2 方法
• 2.1 姬松茸提取物组分的制备
• 2.1.1 姬松茸干粉水抽提物的制备
• 2.1.2 姬松茸提取物不同组分的分离制备
• 2.2 姬松茸提取物组分的成分测定
• 2.2.1 姬松茸提取物组分总糖含量的测定
• 2.2.2 姬松茸提取物组分蛋白质含量的测定
• 2.3 姬松茸提取物组分对细胞毒性的研究
• 2.3.1 姬松茸提取物组分处理细胞后的形态学观察
• 2.3.2 MTT法对姬松茸提取物处理后的细胞活性测定
• 3 结果
• 3.1 姬松茸水抽提物的梯度酒精提取物组分的得率
• 3.2 姬松茸提取物组分测定
• 3.2.1 姬松茸提取物组分的多糖含量
• 3.2.2 姬松茸提取物组分的蛋白质含量
• 3.3 姬松茸提取物组分对大菱鲆鳍细胞的毒性研究
• 3.3.1 姬松茸提取物组分对细胞影响的形态学观察
• 3.3.2 姬松茸提取物组分处理细胞后的活性检测结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 第三章 姬松茸提取物组分体外抗病毒感染活性的研究
• 1 材料及用品
• 1.1 实验材料
• 1.2 主要的实验仪器
• 1.3 实验药品
• 1.4 常用溶液配方
• 2 方法
• 2.1 淋巴囊肿病毒的分离制备及其鉴定
• 2.2 淋巴囊肿病毒感染大菱鲆鳍细胞实验
• 2.3 姬松茸提取物组分对淋巴囊肿病毒感染大菱鲆鳍细胞的影响途径研究
• 2.3.1 姬松茸提取物不同组分处理2 h后淋巴囊肿病毒对细胞的感染作用
• 2.3.2 淋巴囊肿病毒和姬松茸提取物不同组分的混合物对细胞的感染作用
• 2.3.3 淋巴囊肿病毒感染4 h后再添加姬松茸提取物不同组分对细胞的影响作用
• 3 结果
• 3.1 淋巴囊肿病毒的电镜观察
• 3.2 淋巴囊肿病毒的感染作用
• 3.3 姬松茸提取物组分对淋巴囊肿病毒感染细胞的影响及抗病毒作用方式
• 3.3.1 姬松茸提取物组分对淋巴囊肿病毒直接灭活作用
• 3.3.2 姬松茸提取物组分对淋巴囊肿病毒吸附或侵入细胞的影响
• 3.3.3 姬松茸提取物组分对淋巴囊肿病毒在细胞内繁殖的影响
• 4 讨论
• 4.1 淋巴囊肿病毒的提取和鉴定
• 4.2 淋巴囊肿病毒感染大菱鲆鳍细胞的实验分析
• 4.3 姬松茸提取物组分体外抗淋巴囊肿病毒感染细胞的作用方式分析
• 5 结论
• 第四章 姬松茸提取物组分体外抗肿瘤活性的研究
• 1 材料及用品
• 1.1 实验材料
• 1.2 主要的实验仪器
• 1.3 实验药品
• 1.4 常用溶液配方
• 2 方法
• 2.1 人宫颈癌、肝癌、胃癌细胞的光学显微镜观察
• 2.2 人宫颈癌、肝癌、胃癌细胞的计数
• 2.3 人宫颈癌、肝癌、胃癌细胞的透射电子显微镜观察
• 2.4 DNA琼脂糖凝胶电泳
• 2.4.1 人宫颈癌、肝癌、胃癌细胞的DNA琼脂糖凝胶电泳
• 2.4.2 人角膜内皮细胞和大菱鲆鳍细胞的DNA琼脂糖凝胶电泳
• 3 结果
• 3.1 姬松茸提取物E4 组分对人宫颈癌、肝癌、胃癌细胞形态的影响
• 3.2 姬松茸提取物E4 组分对人宫颈癌、肝癌、胃癌细胞增殖的影响
• 3.3 姬松茸提取物E4 组分对人宫颈癌、肝癌、胃癌细胞结构的影响
• 3.4 姬松茸提取物E4 组分处理后人宫颈癌、肝癌、胃癌细胞的DNA琼脂糖凝胶电泳
• 3.5 姬松茸提取物E4 组分处理后人角膜内皮细胞和大菱鲆鳍细胞的DNA琼脂糖凝胶电泳
• 4 讨论
• 4.1 姬松茸提取物组分对体外培养的人宫颈癌、肝癌、胃癌细胞增殖的抑制作用
• 4.2 姬松茸提取物E4 组分对人宫颈癌、肝癌、胃癌细胞形态结构的影响作用分析
• 4.3 姬松茸提取物E4 组分对人宫颈癌、肝癌、胃癌、人角膜内皮和大菱鲆鳍细胞DNA的影响作用分析
• 4.4 姬松茸提取物E4 组分体外诱导人宫颈癌、肝癌、胃癌细胞凋亡分析
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 硕士期间发表的论文