BMSCs在皮肤创伤修复中的作用

论文摘要

皮肤是人体面积最大的器官,也是机体自我更新速度最快的组织之一,它是机体免于脱水、损伤、感染的第一道防线,是维持内环境稳定和阻止微生物、化学物质等侵入的屏障。尽早覆盖创面,恢复皮肤的屏障功能,十分重要。常规的治疗方法采用自体皮肤或同种异体、异种皮肤的移植和人工替代物覆盖等,由于存在着供皮来源有限,同种异体、异种皮肤移植有免疫排斥反应或传染疾病的危险,人工皮肤费用昂贵等问题,常规方法难以满足临床应用的需要。因此,促进皮肤创伤修复已成为组织修复领域亟待解决的难题之一,研究皮肤创伤愈合修复具有重要的理论和实际意义。成体干细胞（adult stem cells,ASCs）是一类具有多向分化潜能的细胞群体,因其存在于各种组织及器官中,来源广泛,不涉及伦理问题,在临床救治中具有广泛的应用前景,已成为近年医学研究和应用的热点之一。目前,ASCs已经从大多数组织中被分离和鉴定,并且能够诱导分化为同一胚层或者不同胚层的细胞类型,显示了其多向分化的潜能。很多研究表明,将ASCs特别是骨髓间充质干细胞（Bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs）应用于组织损伤修复,取得很好的效果。创伤形成的创面从根本上说是组织缺损,而干细胞独特的多向分化潜能、自我更新能力和增殖分化能力强的重要特性,正好满足皮肤修复的需要。大量实验研究发现,BMSCs在体内、体外可以分化为表皮细胞、成纤维细胞以及血管内皮细胞,这都为干细胞治疗皮肤创伤后缺损提供了理论支持。因此,针对皮肤创伤修复,本研究将BMSCs引入皮肤创伤后的创面治疗,围绕干细胞在创伤部位募集这一主题,明确BMSCs可以通过动员、募集作用参与创伤后组织修复,进一步作深入细致的研究,并初步探讨干细胞在创伤部位募集的机制,为临床治疗各种皮肤缺损提供了新的治疗思路。本研究首先对小鼠的BMSCs进行分离、培养,并对其进行诱导分化、鉴定,在此基础上观察了移植的BMSCs在皮肤创伤修复过程中募集现象,重点明确移植的BMSCs可以向创面募集,促进皮肤创伤的修复;同时,我们进一步探讨了其可能的机制,根据已知的趋化原理,采用基因转染的方法修饰BMSCs,促进BMSCs向创面的迁移,增加BMSCs向创面募集的数量,进一步提高BMSCs修复皮肤创伤的效果。主要结果和结论:1.本实验采用全骨髓贴壁法分离纯化BALB/C雄性小鼠的BMSCs,体外培养可大量扩增和传代,获得了体外培养扩增BMSCs的简单、稳定、高效的方法;通过实验鉴定及观察,BMSCs体外具有成骨、成脂肪诱导分化的潜能,已经符合种子细胞的基本条件,无论其“质和量”均能够满足进一步研究和应用的需要。2.本实验中采用Co60全身照射（照射剂量3.5Gy）,使骨髓产生放射性损伤以造成受体骨髓灭活,为移植的BMSCs留出空间,减少了动物自体骨髓干细胞的影响,移植培养的BMSCs后,成功建立骨髓移植嵌合体模型,以模拟自体BMSCs的作用,满足实验需求。本实验骨髓移植嵌合体皮肤创伤动物模型的成功建立,为各种免疫功能不同小鼠放创复合伤模型建立提供了参考。3.本实验中,利用了三种不同细胞标记方式:CFDA-SE荧光标记、Y染色体标记、携带GFP基因的病毒载体转染标记BMSCs,通过给受体雌性BALB/C小鼠尾静脉注射来源于供体雄性BALB/C小鼠的标记BMSCs,分别利用组织切片后普通荧光显微镜观察,定量Real-timePCR检测创面组织中Y染色体的表达,以及冰冻切片后DAPI复染激光共聚焦显微镜观察,结果显示,无论从直观的现象观察,还是从创面组织Y染色体检测,都清楚地证实了BMSCs可以募集到创面,并参与了皮肤创伤的修复。4.创伤后免疫功能正常的BALB/C鼠创面的愈合时间为14.00±1.41d,而免疫功能缺陷的裸鼠、SCID鼠创面的愈合时间分别为17.16±1.17d和19.83±0.76d,与BALB/C鼠比较存在显著差异（P<0.01）。5.本实验通过RT-PCR检测创面组织中SDF-1的基因表达发现,创面愈合过程中BALB/C鼠SDF-1基因表达于伤后1d即有增高, 5d达峰值（P<0.01） ,然后逐渐下降,但仍明显高于对照组,14d创面基本愈合时接近对照组。而裸鼠、SCID鼠创面中SDF-1基因表达于伤后逐渐增高,所测时相点中伤后7d达峰值（P<0.01）,与BALB/C鼠相比,SDF-1基因表达峰值延后,然后逐渐下降, 14d创面未愈合时,SDF-1基因表达仍高于对照组。本研究结果表明,SDF-1既是调节局部炎症的重要趋化因子,也是调节组织器官损伤修复的关键细胞因子。正常皮肤基础性表达SDF-1;创伤后,创面SDF-1表达增加,BMSCs募集到达创面,参与修复。另外机体的免疫功能也将影响BMSCs募集,从而影响创面愈合。这为临床上治疗各种创面,加速创面的尽早愈合提供了新的研究思路和方法。6.本实验成功地构建了CXCR4的腺病毒表达载体Adv-CXCR4,并转染BMSCs,尾静脉回输BMSCs检测创面组织中Y染色体的表达,结果显示:无论未转染Adv-CXCR4的BMSCs还是Adv-CXCR4转染的BMSCs移植,伤后1d,创面即检测到Y染色体,最高峰出现在伤后5d,持续明显表达14d以上;与未转染Adv-CXCR4的BMSCs相比,Adv-CXCR4转染的BMSCs移植后能更多地分布于BALB/C鼠的创面,二者相差显著（P<0.01）。同时,将Adv-CXCR4转染的BMSCs移植到BALB/C鼠的体内后,其创面平均愈合时间为12.46±1.17d,较移植未转染Adv-CXCR4的BMSCs的创面平均愈合时间14.00±1.41d,提前了1.52d。

论文目录

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• 英文摘要
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• 论文正文 BMSCs 在皮肤创伤修复中的作用
• 前言
• 参考文献
• 实验一 BMSCs 的分离、培养及诱导分化、鉴定
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 实验二 BMSCs 在皮肤创伤修复过程中募集现象的观察
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 实验三 SDF-1 在BMSCs 促进皮肤创伤修复过程中的作用研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 实验四 CXCR4 基因修饰的BMSCs 对皮肤创伤修复的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 全文结论
• 致谢
• 文献综述 SDF-1/CXCR4 轴的研究进展
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表论文
• 英文论著