鹤性别鉴定及线粒体遗传多样性与鹤系统发育分析

论文摘要

本试验使用PCR技术和电泳检测技术,利用CHD基因和EE0.6序列的相关引物及引物组合,对白枕鹤、蓑羽鹤、黑冠鹤、丹顶鹤、灰鹤共52个个体进行了准确的性别鉴定。为了了解鹤类的遗传多样性状况,本研究利用鸟类线粒体DNA控制区通用引物对白枕鹤、蓑羽鹤、丹顶鹤、灰鹤共42个个体进行PCR扩增,并以获得的序列为基础,设计了鹤类线粒体DNA控制区特异性引物,通过对上述鹤线粒体DNA控制区部分序列PCR产物进行克隆测序,深入系统地评估群体的遗传多样性水平,探讨四种鹤的系统发育关系。主要研究结果如下:1、利用CHD基因引物2550F/2718R和EE0.6序列的九个引物组合对白枕鹤、蓑羽鹤、黑冠鹤、丹顶鹤和灰鹤总DNA进行扩增,扩增产物经检测显示雌性为两条带,雄性为一条带,成功鉴定了这五种鹤共52个个体的性别,并有效防止假阴性结果的干扰。2、对白枕鹤、蓑羽鹤、丹顶鹤和灰鹤共45条线粒体DNA控制区长度为605bp的序列进行系统分析,得到A、C、G、T这4种核苷酸的平均比例分别为28.80%、23.80%、14.50%和32.90%。A+T含量61.70%,高于G+C含量;共发现79个变异位点,约占分析位点总数的13.72%,其中单一多态位点20个（3.47%）,简约信息位点59个（10.24%）。共发现7种变异类型:转换,颠换,插入/缺失,以及转换和颠换在同一位点上,插入/缺失和转换在同一位点上,插入/缺失和颠换在同一位点上,插入/缺失和转换、颠换在同一位点上。79个变异位点中,转换66次,占83.54%;颠换6次占7.59%;转换和颠换在同一位点7次,占8.86%;共有插入/缺失29次（4.79%,29/605）,其中插入/缺失与转换在同一位点上7次;插入/缺失与颠换在同一位点上1次;插入/缺失和转换、颠换在同一位点上1次。共发现33种单倍型,各个鹤群体间没有共享单倍型。四个鹤群体单倍型多样度差异不大,从0.889到1.000,单倍型多样度总体为0.974±0.018,可见总体的单倍型多样度丰富;白枕鹤的核苷酸多样度最高,为0.684%,四种鹤总体的平均核苷酸差异数为23.941,核苷酸多样度为4.156%,可见四个鹤群体内部的多样性程度较低,而群体间的多样性程度较高。群体间核苷酸分歧度（Dxy）在5.225%～6.649%之间变化,核苷酸净遗传距离（Da）为4.847%～6.270%,核苷酸分歧度和核苷酸净遗传距离差异均不大。四种鹤群体间kimura双参数距离变异范围为0.054～0.070。四种鹤线粒体DNA控制区序列群体间的方差组分（Va）占总变异的93.86%,群体内的方差组分（Vb）占总变异的6.14%。Fst=0.93863,差异极显著（P <0.01）,四种鹤间存在显著的遗传分化。3、对四种鹤线粒体DNA控制区33种单倍型构建系统发生树和网络关系图, NJ、ME和UPGMA分子系统树明显分为4个类群,各类群中包含的单倍型为各个鹤群体所特有。单倍型网络关系图中的序列也明显聚为4个聚类簇,与单倍型系统发生树的结果完全一致。线粒体DNA控制区部分序列单倍型的系统发生树中,丹顶鹤的特定单倍型和灰鹤所独有的单倍型聚为一类,之后与只出现在蓑羽鹤中的单倍型聚为一类,最后与白枕鹤的特定单倍型聚为一大类。4、对测定的四种鹤控制区序列采用Tajima’s D值进行中性检验,结果发现除蓑羽鹤外,各群体中性检验的Tajima’s D值介于-1.16172和-1.47797之间,经检验均不显著（P >0.05）,符合中性突变。但是蓑羽鹤中性检验的Tajima’s D值为-2.01307（P﹤0.05）,不符合中性突变。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 鹤类简介
• 1 鹤的分类
• 2 世界十五种鹤的生物学习性及地理分布
• 3 鹤类的保护
• 3.1 就地保护
• 3.1.1 建立自然保护区
• 3.1.2 栖息地的保护与修复
• 3.1.3 加强保护鹤类迁飞途中的停歇地和越冬地
• 3.1.4 进行数量分布调查
• 3.1.5 开展宣传教育与国际合作
• 3.2 易地保护
• 3.2.1 笼养的种类和数量
• 3.2.2 人工饲养繁殖
• 3.2.3 野外放飞
• 3.3 法律与公约保护
• 3.3.1 《中华人民共和国野生动物保护法》和《国家重点保护野生动物名录》
• 3.3.2 世界自然保护联盟（IUCN）和国际鸟类保护联盟（Bird Life）
• 3.3.3 国际公约
• 4 鹤类研究现状
• 第二章 鹤类性别鉴定
• 1 文献综述
• 1.1 形态学方法
• 1.2 细胞生物学方法
• 1.3 分子生物学方法
• 1.3.1 DNA 含量测定法
• 1.3.2 性染色体特异性DNA 探针法
• 1.3.3 PCR 法
• 1.3.3.1 CHD 基因鉴定法
• 1.3.3.2 ATP5A1 基因鉴定法
• 1.3.3.3 EE 0.6 序列鉴定法
• 1.3.3.4 鸟类性别鉴定的通用序列鉴定法
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要溶液的配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 羽毛基因组DNA 的提取
• 2.2.2 性别相关基因的引物
• 2.2.3 PCR 扩增及检测
• 3 结果与分析
• 3.1 CHD 基因相关引物2550F/2718R 的扩增结果
• 3.2 EE0.6 序列相关引物组合的扩增结果
• 4 讨论
• 4.1 基因组DNA 的提取
• 4.2 CHD 基因、EE0.6 序列与性别鉴定
• 第三章 鹤线粒体DNA 控制区序列遗传多样性及鹤系统发育关系分析
• 1 文献综述
• 1.1 研究遗传多样性的意义、内容和方法
• 1.1.1 遗传多样性的概念
• 1.1.2 野生动物遗传多样性概况
• 1.1.3 动物遗传多样性保护的意义
• 1.1.4 动物遗传多样性评价的内容
• 1.1.5 动物遗传多样性的研究方法
• 1.1.5.1 形态学方法
• 1.1.5.2 细胞遗传学方法
• 1.1.5.3 蛋白质检测方法
• 1.1.5.4 分子生物学方法
• 1.1.6 动物遗传多样性评价指标
• 1.1.6.1 平均数和变异系数
• 1.1.6.2 基因和基因型频率
• 1.1.6.3 遗传平衡检验
• 1.1.6.4 遗传变异的度量参数
• 1.1.6.5 遗传距离估计数学模型
• 1.1.6.6 系统发育分化的推断方法
• 1.2 线粒体DNA 控制区及其在保护遗传学中的应用
• 1.2.1 脊椎动物及鸟类线粒体DNA 的结构特性
• 1.2.2 鸟类线粒体DNA 控制区的结构特点及序列变异特征
• 1.3 线粒体DNA 在保护遗传学中的应用及其优劣之处
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 菌株与质粒
• 2.1.5 主要溶液的配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 从血液中提取基因组DNA
• 2.2.2 利用通用引物扩增、克隆鹤线粒体DNA 控制区序列片段
• 2.2.2.1 利用通用引物扩增鹤线粒体DNA 控制区部分序列
• 2.2.2.2 扩增所得片段的电泳检测
• 2.2.2.3 扩增所得DNA 片段的克隆
• 2.2.2.3.1 DNA 纯化
• 2.2.2.3.2 感受态细胞的制备
• 2.2.2.3.3 连接
• 2.2.2.3.4 转化
• 2.2.2.3.5 筛选
• 2.2.2.3.6 重组质粒DNA 的小规模提取和鉴定
• 2.2.2.4 测序
• 2.2.2.5 数据分析
• 2.2.3 利用自行设计的引物进行鹤线粒体 DNA 控制区序列的多态性分析
• 2.2.3.1 利用自行设计的引物进行PCR 扩增
• 2.2.3.2 扩增所得DNA 片段的电泳检测
• 2.2.3.3 扩增所得DNA 片段的克隆和测序
• 2.2.3.4 数据分析
• 2.2.4 统计方法及软件应用
• 2.2.4.1 核苷酸序列多态性分析
• 2.2.4.2 单倍型间的系统进化分析
• 2.2.4.3 单倍型间的网络分析
• 3 结果与分析
• 3.1 通用引物对鹤线粒体DNA 控制区序列的扩增、克隆、测序结果
• 3.1.1 通用引物扩增产物的电泳检测结果
• 3.1.2 通用引物扩增产物的克隆结果
• 3.1.3 测序结果
• 3.1.4 数据分析
• 3.2 利用自行设计的引物对鹤线粒体DNA 控制区序列的扩增、克隆与测序
• 3.2.1 引物BZ-For/BZ-Rev、BZ-S/SY-A 对鹤进行PCR 扩增的结果
• 3.2.2 扩增产物单克隆的PCR 检测结果
• 3.2.3 测序结果
• 3.2.4 数据分析结果
• 3.3 鹤线粒体DNA 控制区部分序列的遗传多样性
• 3.3.1 鹤线粒体DNA 控制区部分序列的序列长度与碱基组成
• 3.3.2 序列的核苷酸多态位点变异
• 3.3.3 序列的核苷酸多态位点的变异类型
• 3.3.4 四个鹤群体mtDNA 控制区单倍型
• 3.4 四个鹤群体mtDNA 控制区部分序列的遗传结构
• 3.4.1 四个鹤群体内单倍型多样度
• 3.4.2 四个鹤群体内核苷酸多样度
• 3.4.3 四个鹤群体间核苷酸多态性
• 3.4.4 四种鹤群体历史动态分析
• 3.4.5 四种鹤群体间遗传距离
• 3.4.6 分子方差分析（Analysis of Molecular Variance，AMOVA）
• 3.5 mtDNA 控制区单倍型的分子系统树
• 3.6 四个鹤群体控制区序列单倍型网络图
• 4 讨论
• 4.1 鹤线粒体DNA 控制区特异性引物的设计
• 4.2 四个鹤群体mtDNA 控制区部分序列的遗传多态性
• 4.3 四个鹤群体内线粒体DNA 控制区遗传多样性
• 4.4 四个鹤群体间线粒体DNA 控制区遗传多样性
• 4.5 鹤的系统发育关系分析
• 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文目录
• 攻读硕士学位期间申请专利目录