非肌肉肌球蛋白Ⅱ型重链A蛋白在PRRSV感染细胞中的作用

论文摘要

猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）归属于套式病毒目动脉炎病毒科属,由该病毒引起的猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）已成为世界养猪业生产中主要疫病之一。该病主要引起妊娠母猪早产、流产、死胎、木乃伊胎等繁殖障碍以及各年龄段猪的呼吸道症状和高死亡率。目前PRRS已经遍及全球主要养猪的国家和地区,给世界养猪业造成了巨大的经济损失。PRRSV侵入宿主细胞首先通过与细胞膜表面上的特异性受体结合,利用细胞内吞作用而感染易感细胞。现已报道的PRRSV感染Marc-145细胞的受体有CD163和Vimentin。CD163属于富含半胱氨酸超家族的清道夫受体蛋白,不但能够结合PRRSV,还能介导病毒在细胞内的复制。Vimentin是一个普遍存在于细胞内的波形蛋白,单克隆抗波形蛋白抗体可以阻断PRRSV对Marc-145细胞的感染,对PRRSV非易感的BHK-21和CRFK细胞在表达了猴的波形蛋白之后变成了PRRSV易感细胞,同时波形蛋白与其它中间细丝蛋白组成的多聚体可能参与PRRSV在细胞内的复制和转移。我的导师周恩民教授利用所制备的针对PRRSV GP5蛋白的单克隆抗独特型抗体（Mab2-5G2）,从PRRSV易感细胞上发现了一个可能的PRRSV细胞受体蛋白。该蛋白为非肌肉肌球蛋白II型重链A（non-muscle myosin heavy chain II-A,NMHC II-A）。NMHC II-A广泛存在于自然界。在哺乳动物中,它是非肌肉肌球蛋白II型（NM II）重链的一个亚型,在整个细胞周期,包括细胞迁移、胞质分裂、细胞吸附和细胞形态变化过程中发挥重要的作用。已有研究证明NMHC II-A与T细胞上的趋化因子受体CXCR4结合,从而介导趋化因子的信号传导,可溶性CD163蛋白通过与T细胞上NMHC II-A的协同作用而结合T细胞,这些都说明了NMHC II-A在免疫反应中的作用。本文主要研究了NMHC II-A对PRRSV感染Marc-145细胞的阻断作用。首先根据NMHC II-A羧基端基因序列人工合成七条多肽,通过病毒中和实验证明其中三条多肽对PRRSV感染Marc-145细胞有阻断作用。为探求NMHC II-A羧基端的生物学功能,从Marc-145细胞中提取总RNA,利用特异性引物,经RT-PCR克隆得到NMHC II-A羧基端基因（命名为PRA）。将PRA连接至pET-28a（+）原核表达载体,经诱导表达得到重组的NMHC II-A羧基端蛋白（命名为PRA蛋白）。经分段表达蛋白,Western-blot和I-ELISA实验证明了PRA蛋白能与Mab2-5G2特异性结合,并且找到了比较准确的结合位点。通过间接免疫荧光实验证明了PRA蛋白能够与Marc-145细胞的细胞膜特异性结合。更重要的是,通过病毒中和实验,荧光病毒中和实验,荧光定量PCR实验证明了PRA蛋白能够在一定程度上阻断PRRSV对Marc-145细胞的感染。将重组质粒pEGFP-N1-PRA转染至Marc-145细胞,与未转染的Marc-145细胞相比,PRRSV感染转染pEGFP-N1-PRA的Marc-145细胞的能力降低了50%。另外,还证明了NMHC II-A的阻断剂（R）-（+）-Blebbistatin对Marc-145细胞的胞质分裂没有影响,但对PRRSV感染Marc-145细胞有阻断作用。这些实验结果充分证明了PRA蛋白在PRRSV感染易感细胞过程中的作用,为进一步研究PRRSV感染细胞的分子机制提供了一定的依据,也为进一步探求PRRS的防控提供了新的思路。

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Abstract

1. 引言

1.1 PRRSV 的生物学特征

1.1.1 PRRSV 的基因组结构

1.1.2 PRRSV 的遗传变异

1.1.3 PRRSV 免疫学反应

1.1.4 PRRSV 致病机制

1.1.5 PRRSV 受体的研究进展

1.1.6 PRRS 的预防和控制

1.2 非肌肉肌球蛋白Ⅱ型重链 A

1.3 Blebbistatin

1.4 研究的目的和意义

2. 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 细胞及 PRRSV 毒株

2.1.2 实验试剂及耗材

2.1.3 质粒及受体菌

2.1.4 主要试剂配制

2.1.5 主要仪器及设备

2.2 方法

2.2.1 Marc-145 细胞的传代及收集

2.2.2 PRRSV 的纯化和扩繁

2.2.3 PRRSV 的 TCID50 的测定

2.2.4 Marc-145 细胞总 RNA 的提取

2.2.5 克隆构建所需引物的设计和合成

2.2.6 RT-PCR 扩增

2.2.7 PCR 产物的回收和连接

2.2.8 氯化钙法制备感受态细胞

2.2.9 重组质粒的转化

2.2.10 重组质粒的提取和鉴定

2.2.11 重组质粒的诱导表达

2.2.12 SDS-PAGE 蛋白质样品的制备和电泳分析

2.2.13 洗涤包涵体和的 Ni 柱纯化原核表达蛋白

2.2.14 原核表达蛋白的 PH 梯度透析复性

2.2.15 Western-blot 鉴定 PRA 蛋白与 Ma62-5G2 结合

2.2.16 I-ELISA 鉴定 PRA 蛋白与 Ma62-5G2 结合

2.2.17 间接免疫荧光实验（Indirect fluorescent assay，IFA）

2.2.18 IFA 实验验证 PRA 蛋白对 Marc-145 细胞的影响

2.2.19 多肽的合成，溶解和保存及 Blebbistatin 的溶解和稀释

2.2.20 （R）-（+）-Blebbistatin 对 Marc-145 细胞的分裂周期的影响的观察

2.2.21 病毒中和实验（Virus neutralization，VN）

2.2.21.1 PRA蛋白对PRRSV感染Marc-145细胞的阻断作用

2.2.21.2 （R）-（+）-Blebbistatin对PRRSV感染Marc-145细胞的阻断作用

2.2.21.3 多肽对PRRSV感染Marc-145细胞的阻断作用

2.2.22 间接免疫荧光实验（IFA）鉴定 PRRSV 感染 Marc-145 细胞

2.2.23 荧光病毒中和实验（Fluorescent focus neutralization，FFN）

2.2.24 荧光定量 PCR 检测 PRRSV 感染量

2.2.25 重组质粒转染 Marc-145 细胞

2.2.26 转染了重组质粒pEGFP-N1-PRA 的 Marc-145 细胞对 PRRSV 感染量变化的检测

3. 结果

3.1 PRA 克隆的结果

3.2 多个重组质粒构建的鉴定结果

3.3 分段蛋白的原核表达鉴定

3.4 Western-blot 确定 PRA 蛋白与 Ma62-5G2 的结合位点

3.5 I-ELISA 确定 PRA 蛋白与 Ma62-5G2 的结合位点

3.6 间接免疫荧光实验鉴定 PRA 蛋白结合 Marc-145 细胞

3.7 IFA 实验验证 PRA 蛋白对 Marc-145 细胞分裂周期的影响

3.8 （R）-（+）-Blebbistatin 对 Marc-145 细胞的胞质分裂的影

3.9 VN 实验探求PRA 蛋白，和（R）-（+）-Blebbistatin 对PRRSV 感染Marc-145 细胞的阻断作用

3.10 VN 实验探求多肽对 PRRSV 感染 Marc-145 细胞的阻断作

3.11 IFA 鉴定 PRRSV 感染 Mar-145 细胞

3.12 FFN 实验探求 PRA 蛋白对 PRRSV 感染 Marc-145 细胞的阻断

3.13 荧光定量 PCR 实验探求重组质粒转染 Marc-145 细胞对 PRRSV 感染

3.14 重组质粒转染 Marc-145 细胞的鉴定

3.15 重组质粒pEGFP-N1-PRA 转染后对 PRRSV 感染 Marc-145 细胞的

4. 讨论

4.1 PRA蛋白对PRRSV感染Marc-145细胞的阻断作用机理的讨论

4.2 转染重组质粒pEGFP-N1-PRA 后对PRRSV 感染Marc-145 细胞的阻断作用的机理的讨论

4.3 PRA 蛋白与抗独特型抗体 Ma62-5G2 的结合位点的确定的讨论

4.4 （R）-（+）-Blebbistatin 对 PRRSV 感染 Marc-145 细胞的阻断作用的讨论

5. 结论

5.1 RT-PCR克隆得到Marc-145细胞中NMHC-ⅡA的羧基端基因(PRA

5.2 非肌肉肌球蛋白Ⅱ型重链A蛋白在PRRSV感染Marc-145细胞中的作用

5.3 PRA蛋白与抗独特型抗体Ma62-5G2的结合位点的确定

5.4 （R）-（+）-Blebbistatin对PRRSV感染Marc-145细胞的阻断作用

6. 参考文献

7. 致谢

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