溶源性发酵乳杆菌及其温和噬菌体的研究

论文摘要

酸奶是国内主要的发酵乳制品，由于具有多种保健功能而深受消费者的青睐。目前，酸奶的生产菌株除了常见的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌外，还有双岐杆菌和嗜酸乳杆菌。为了进一步改善酸奶的保健功能，生产各种特色酸奶，很有必要对其它益生乳杆菌的生理特性进行详细研究。像乳酪发酵过程一样，酸奶生产也同样受到噬菌体的威胁。随着国内酸奶生产规模和种类的增加，噬菌体的危害也逐渐显现出来，甚至导致酸奶发酵的失败。但目前国内外对于酸奶生产菌株噬菌体的研究报道较少，国内尚处空白。鉴于上述情况，本论文重点对酸奶来源的乳杆菌及其噬菌体进行研究，以期为降低酸奶发酵过程中噬菌体的污染奠定理论基础。 本实验从国内20种不同品牌酸奶中分离到20株杆菌，经形态观察、革兰氏染色、过氧化氢酶反应等特性分析初步证明是乳杆菌。利用丝裂霉素C（MMC）诱导法，对上述20株乳杆菌进行溶源性检测，结果发现其中7株是溶源性菌株。诱导的噬菌体经过电镜观察发现，形态均呈典型的蝌蚪状，有六边形的头、长而非收缩性的尾，在噬菌体分类中属于有尾噬菌体目（Urovirales）、Siphoviredae科（指具有长而非收缩性尾）。经限制性内切酶分析，7个噬菌体的基因组DNA具有相同的限制性内切酶图谱，推断它们为同一种噬菌体，命名为φYB5，宿主菌为乳杆菌YB5。 通过SDS-PAGE对噬菌体φYB5外壳蛋白进行分析，得知其外壳蛋白的主要成分是一个分子量为31.9kDa的蛋白，同时对其包装机制的研究发现，该噬菌体的DNA包装机制为pac-型。进一步对溶源性菌株YB5及其相应的治愈菌株YB5-A生长特性比较，治愈菌株细胞多呈分散状排列，单个细胞稍长，菌落稍大；而溶源性菌株的细胞多聚为簇状，单个细胞略短，菌落也稍小一点，可能是前噬菌体的存在增加了溶源性菌株的代谢负担。 对溶源性菌株YB5进行16SrDNA基因测序鉴定。利用PCR扩增该菌株的

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明及缩写词
• 第一章 绪论
• 1.1 乳酸菌
• 1.1.1 概述
• 1.1.2 发酵乳杆菌的发现及其在乳酸菌分类中的地位
• 1.1.3 发酵乳杆菌的应用研究
• 1.2 噬菌体
• 1.2.1 噬菌体的研究概况
• 1.2.2 噬菌体的形态与分类
• 1.3 乳酸菌噬菌体
• 1.3.1 乳酸菌噬菌体的危害
• 1.3.2 乳酸菌噬菌体的分类
• 1.3.3 乳酸菌噬菌体的生活周期
• 1.3.4 乳酸菌噬菌体的包装机制
• 1.4 乳酸菌噬菌体基因组的研究
• 1.4.1 乳酸菌噬菌体基因组的研究现状
• 1.4.2 乳酸菌噬菌体基因组的组成及结构特征
• 1.4.3 几类主要的乳酸菌噬菌体基因组特征
• 1.4.4 乳酸菌噬菌体基因组的进化分析
• 1.5 本文的研究意义和主要研究内容
• 第二章 乳杆菌温和噬菌体的分离纯化及其生物学性质的研究
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 培养基及试剂
• 2.2.2 乳杆菌的分离纯化及初步鉴定
• 2.2.3 温和噬菌体的诱导
• 2.2.4 噬菌体的浓缩
• 2.2.5 噬菌斑的检测
• 2.2.6 噬菌体颗粒的形态观察
• 2.2.7 噬菌体基因组的提取
• 2.2.8 噬菌体基因组DNA限制性酶切图谱分析
• 2.2.9 噬菌体外壳蛋白的SDS-PAGE分析
• 2.2.10 前噬菌体治愈菌株的制备及验证
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 乳杆菌的分离纯化与初步鉴定
• 2.3.2 温和噬菌体的诱导
• 2.3.3 噬菌体颗粒的形态观察
• 2.3.4 噬菌体颗粒的限制性酶切图谱分析
• 2.3.5 噬菌体外壳蛋白的SDS-PAGE分析
• 2.3.6 包装体制的证明
• 2.3.7 治愈菌株的验证
• 2.3.8 溶源菌株与治愈菌株细胞和菌落形态的比较
• 2.3.9 溶源菌株与治愈菌株的生长及发酵特性比较
• 2.4 小结
• 第三章 溶源性菌株YB5 16S rDNA鉴定及其生理特征的研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌株与载体
• 3.2.2 培养基
• 3.2.3 细菌基因组DNA提取
• 3.2.4 用16S rDNA方法对YB5菌株鉴定
• 3.2.5 耐渗透压能力的测定
• 3.2.6 耐胆酸盐能力的测定
• 3.2.7 耐酸能力的测定
• 3.2.8 淀粉酶活力的测定
• 3.2.9 发酵乳杆菌YB5抑菌活性的测定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 溶源性菌株YB5 16S rDNA序列鉴定
• 3.3.2 发酵乳杆菌YB5耐渗透压的能力
• 3.3.3 发酵乳杆菌YB5的耐酸性
• 3.3.4 发酵乳杆菌YB5淀粉酶活力测定
• 3.3.5 发酵乳杆菌YB5抑菌活性的研究
• 3.4 小结
• 第四章 温和噬菌体ΦYB5基因组序列的测定及其生物信息学分析
• 4.1 引言
• 4.2 材料
• 4.2.1 菌株与质粒
• 4.2.2 培养基及主要试剂
• 4.3 方法
• 4.3.1 噬菌体ΦYB5基因组的提取
• 4.3.2 噬菌体ΦYB5基因组序列的测定
• 4.3.3 测序结果的分析及序列拼接
• 4.3.4 重叠群的生物信息学分析
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 噬菌体ΦYB5基因组DNA的制备
• 4.4.2 噬菌体ΦYB5基因组序列的测定
• 4.4.3 重叠群的生物信息学分析
• 4.5 小结
• 第五章 噬菌体蛋白的结构预测、进化分析及裂解素基因原核表达载体的构建
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 噬菌体蛋白的结构预测及功能分析软件
• 5.2.2 质粒和载体
• 5.2.3 裂解素基因原核表达载体的构建
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 前头部成熟蛋白酶的结构预测与进化分析
• 5.3.2 主要头部蛋白的结构预测及进化分析
• 5.3.3 穿孔素蛋白的结构预测及进化分析
• 5.3.4 裂解素蛋白的结构预测及进化分析
• 5.3.5 整合酶蛋白的结构预测及进化分析
• 5.3.6 穿孔素和裂解素跨膜结构域的预测
• 5.3.7 裂解素信号肽的预测
• 5.3.8 噬菌体ΦYB5裂解素基因原核表达载体的构建
• 5.4 小结
• 参考文献
• 附录 课题涉及的引物信息统计表
• 读博期间发表的文章
• 致谢