重组腺病毒心肌营养素-1转染对神经干细胞的作用

论文摘要

目的：观察重组腺病毒心肌营养素-1（Adv-CT-1）转染对神经干细胞（NSCs）的保护作用及对定向分化为γ-氨基丁酸（GABA）能神经元的影响。方法：1.分离、培养及鉴定新生Wistar大鼠海马NSCs,观察不同传代方法对NSCs的影响。2.Adv-CT-1及重组腺病毒增强型绿色荧光蛋白（Adv-EGFP）转染NSCs。将Adv-CT-1及Adv-EGFP分别以感染复数（MOI）为25、50、100、200 PFU/细胞转染NSCs,于转染后24、48、72、96h细胞免疫荧光染色检测CT-1表达率,荧光显微镜下观察EGFP的表达。3.Adv-CT-1转染对NSCs的保护作用。将NSCs随机分为单纯谷氨酸（Glu）组、CT-1干预组（Adv-CT-1转染,MOI为200PFU/细胞）及正常对照组,其中单纯Glu组和CT-1干预组暴露于50μmol/L的Glu培养液30 min,正常对照组不予处理。于12、24、48、72 h采用四唑蓝比色实验（MTT）了解细胞存活情况及原位缺口末端标记技术（TUNEL）检测细胞凋亡。4. Adv-CT-1转染对NSCs分化为GABA能神经元的影响。将NSCs随机分为Adv-CT-1转染组（Adv-CT-1转染,MOI为200 PFU/细胞）、血清组（培养基中添加10%的胎牛血清）及对照组（不予任何处理）,于1、3、5、7d采用细胞免疫荧光染色检测分化为GABA能神经元比率。结果：1.新生大鼠海马分离的神经干细胞具有连续增殖能力,可表达巢蛋白（Nestin）,经诱导可分化为神经元和星形胶质细胞。NSCs传代时使用大鼠神经小球分离试剂盒较机械吹打法可以更好地保持NSCs的存活,减少NSCs死亡,有利于NSCs增殖。2.Adv-CT-1转染NSCs后24、48、72、96 h CT-1表达率：MOI为25 PFU/细胞时分别为27.09%±4.25%、32.21%±4.96%、36.49%±2.31%及34.24%±4.02%；MOI为50 PFU/细胞时分别为37.73%±3.50%、47.49%±2.87%、55.19%±4.54%及53.16%±4.87%;MOI为100 PFU/细胞时分别为54.82%±3.00%、67.19%±3.54%、75.10%±3.97%及72.81%±2.94%;MOI为200 PFU/细胞时分别为65.40%±3.74%、80.36%±4.35%、83.55%±3.07%及81.20%±3.13%。CT-1的表达率随MOI的上升而升高,呈浓度依赖性。Adv-CT-1以不同MOI转染NSCs后CT-1的表达率均在72 h达高峰。Adv-EGFP转染NSCs后24、48、72、96 h EGFP转染率：MOI为25 PFU/细胞时分别为53.95%±5.19%、63.35%±2.43%、65.25%±2.29%及67.41%±4.16%；MOI为50 PFU/细胞时分别为63.80%±6.43%、72.03%±4.34%、75.52%±2.51%及77.52%±4.29%；MOI为100 PFU/细胞时分别为71.50%±3.80%、84.96%±3.49%、86.71%±4.00%及88.05%±3.59%；MOI为200 PFU/细胞时分别为73.30%±2.50%、87.19%±3.50%、90.06%±2.87%及91.50%±3.40%。EGFP转染率随MOI的上升而升高,呈浓度依赖性。以不同MOI转染NSCs后EGFP的转染率均在96h达高峰。3.暴露于Glu后12、24、48、72hMTT吸光度（OD）值单纯Glu组分别为0.317±0.035、0.262±0.034、0.332±0.050及0.386±0.030；CT-1干预组分别为0.375±0.033、0.323±0.031、0.412±0.027及0.480±0.055,24 h两组OD值均降至最低。正常对照组12、24、48、72 h OD值分别为0.445±0.043、0.534±0.039、0.646±0.065及0.766±0.058。各时间点OD值正常对照组均高于单纯Glu组和CT-1干预组,CT-1干预组均高于单纯Glu组,组间两两比较有显著差异（P<0.05）。暴露于Glu后12、24、48、72 h细胞凋亡率单纯Glu组分别为30.45%±5.91%、41.65%±4.35%、30.15%±2.96%及21.13%±3.91%；CT-1干预组分别为20.47%±2.30%、26.63%±3.31%、20.77%±2.61%及10.70%±3.30%,24 h两组细胞凋亡率均升至最高。正常对照组12、24、48、72 h细胞凋亡率分别为2.48%±0.65%、2.94%±0.68%、2.80%±0.62%及3.08%±0.51%。各时间点细胞凋亡率正常对照组均低于CT-1干预组和单纯Glu组,CT-1干预组均低于单纯Glu组,组间两两比较有显著差异（P<0.05）。4.于1、3、5、7d NSCs分化为GABA能神经元的比率：Adv-CT-1转染组分别为8.49%±2.05%、22.65%±2.60%、36.70%±3.05%及46.02%±5.77%；血清组分别为3.19%±0.79%、8.92%±1.58%、17.79%±3.33%及19.73%±3.83%；对照组分别为0.34%±0.27%、0.92%±0.55%、1.24%±0.45%及1.46%±0.52%。7d时各组分化为GABA能神经元的比率均升至最高,其中以Adv-CT-1转染组为最高。各时间点NSCs分化为GABA能神经元的比率Adv-CT-1转染组高于血清组和对照组,血清组高于对照组,组间两两比较有显著差异（P<0.05）。7 d与14 d GABA能神经元细胞数相比较,Adv-CT-1转染组无显著差异（t=2.445,P>0.05）,血清组有明显差异（t=5.96,P<0.01）。结论：1.从新生大鼠海马中可成功分离培养出NSCs,利用大鼠神经小球分离试剂盒可以有效地进行传代。2. Adv-CT-1和Adv-EGFP可以有效地转染NSCs,并在NSCs中高效表达,同时EGFP荧光表达能间接反映CT-1的表达情况,可以作为报告基因对CT-1及其转染的NSCs进行示踪。3.Adv-CT-1对谷氨酸损伤的NSCs具有保护作用,可以抑制NSCs凋亡,促进其存活和增殖。4.Adv-CT-1可以促进NSCs向GABA能神经元分化及其存活。

论文目录

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• 结论
• 参考文献
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• 综述
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• 致谢