荧光光谱法检测乙肝病毒HBV-DNA和凝血酶的研究

论文摘要

乙肝病毒是当前传染性很强的一种病毒,可引起慢性肝炎和肝硬化。因此,发展一种高灵敏的和高选择性的检验乙肝病毒的方法成为热点课题之一。凝血酶是一种常见的蛋白质,它在分子生物学中起着重要的作用,许多工作都致力于发展灵敏度高的凝血酶传感器。核酸适体与靶分子之间分子的识别功能与抗体与抗原的识别非常相似,作为一种新型的分子识别工具,可以与适配体作用的靶分子种类很多（包括免疫原性弱及不具有免疫原性的物质和毒素）,同时,核酸适体具有自身稳定性强、易功能化修饰、变性复性快速、可逆标记和可作为优良的纳米器件等优点。因此,核酸适体作为识别分子的分析技术得到迅速的发展。本论文主要分为以下四个部分:（1）利用核酸外切酶Ⅲ降解杂交的DNA链,将荧光素修饰的DNA探针释放到溶液中,通过测定溶液的荧光强度来测定乙肝病毒（HBV-DNA）的浓度。考察了缓冲溶液的种类、pH、反应时间等对反应体系荧光强度的影响,确定了最佳反应条件:最佳缓冲溶液为TT缓冲溶液（pH 8.0,250 mM Tris-HCl,0.1% （V/V） Tween 20）,缓冲溶液的最佳pH为9.0,生物素与亲和素最佳结合时间为25 min,DNA的最佳杂交时间为20 min,酶反应最佳时间为1.1 h。在最佳反应条件下,随着HBV-DNA浓度的增加,体系的荧光强度明显增强。该方法测定HBV-DNA的线性范围为5.0×10-13～5.0×10-12M,检测限为3.35×10-13M。（2）利用纳米金放大的方法,将修饰荧光素的信号DNA连接在纳米金表面,纳米金通过HBV-DNA与磁珠连接,1,4-二硫苏糖醇（DTT）可以替代信号DNA连接在纳米金表面,使荧光素标记的信号DNA脱离纳米金到溶液中,测定溶液的荧光强度可以得到HBV-DNA的浓度。磁珠不仅可以用来磁性分离,还可以降低DNA的非特异性吸附。同时,纳米金有放大信号的功能。基于纳米金放大原理的荧光光谱体系中测定的HBV-DNA的检测限为2.18×10-14 M。（3）利用涂覆亲和素的96孔板和纳米金磁性微球来检测HBV-DNA的浓度。纳米金磁性微球不仅可以放大信号,还可以利用其可磁性分离的特点减小DNA的非特异性吸附。利用DTT代替反应,使得修饰荧光素的信号DNA脱离纳米金磁性微球表面悬浮在溶液中,通过荧光光谱法测定溶液中的荧光强度来得到HBV-DNA的浓度。信号的放大和低背景使得该方法检测限为7.52 fM,可用于随时检测HBV-DNA的浓度。（4）基于凝血酶与其两种适体之间特异性结合设计了一种灵敏的和特异性的夹心结构来检测凝血酶的浓度。连接在纳米金表面的识别DNA（S3）与引发DNA（S4）可部分杂交,由于取代DNA（S5）与识别DNA可完全杂交,从而引发DNA被释放到溶液中。溶液中的S4可打开发卡DNA S6,被打开的S6又可以打开发卡DNA S7而释放S4重新回到溶液中,释放到溶液中的S4可打开S6引发下一轮循环反应。这样的循环反应可增大荧光信号,提高检测的灵敏度,检测限为4.3×10-13M。用牛血清蛋白和溶菌酶来检验该方法的选择性,结果表明,该方法具有足够高的选择性,同时,在实际样品中也有很好的选择性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 乙型肝炎概述
• 1.1.1 乙型肝炎流行现状及危害
• 1.1.2 HBV 的结构
• 1.1.3 HBV 的病毒基因组
• 1.1.4 DNA 的研究及HBV 基因分型方法
• 1.2 凝血酶与适体
• 1.2.1 凝血酶概述
• 1.2.2 适体概述
• 1.2.2.1 适体的筛选方法
• 1.2.2.2 适体的特点
• 1.2.2.3 适体与配体的相互作用
• 1.2.2.4 适体技术的应用
• 1.2.3 凝血酶适体的构象
• 1.3 纳米金概述
• 1.3.1 纳米技术与纳米金
• 1.3.2 纳米金的制备方法
• 1.3.3 纳米金的应用
• 1.4 荧光分析法及磁性分离技术
• 1.4.1 荧光分析法的原理
• 1.4.2 生物磁分离技术及其在生物分析中的应用
• 1.5 课题立项依据及研究内容
• 第二章 基于核酸外切酶Ⅲ降解原理荧光检测乙肝病毒 HBV-DNA
• 2.1 实验部分
• 2.1.1 实验仪器与试剂
• 2.1.2 实验方法
• 2.1.2.1 修饰荧光素的信号DNA 的荧光光谱测定
• 2.1.2.2 条件优化实验
• 2.1.3 测定HBV-DNA 的工作曲线
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 荧光法检测HBV-DNA 原理
• 2.2.2 实验条件的优化
• 2.2.2.1 缓冲溶液的选择
• 2.2.2.2 缓冲溶液最佳pH 的选择
• 2.2.2.3 生物素与亲和素结合时间的选择
• 2.2.2.4 DNA 杂交时间的选择
• 2.2.2.5 酶反应时间的选择
• 2.2.3 工作曲线及检测限
• 2.3 小结
• 第三章 纳米金放大法荧光检测 HBV-DNA
• 3.1 实验部分
• 3.1.1 实验仪器与试剂
• 3.1.2 实验方法
• 3.1.2.1 纳米金的合成
• 3.1.2.2 纳米金上连接DNA
• 3.1.2.3 磁珠和纳米金的连接
• 3.1.2.4 DTT 和纳米金表面DNA 取代反应
• 3.1.2.5 条件优化实验
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 实验原理讨论
• 3.2.2 纳米金电镜和紫外分析
• 3.2.3 实验条件的优化
• 3.2.3.1 生物素与亲和素结合时间的优化
• 3.2.3.2 探针DNA 和目标DNA 杂交时间的优化
• 3.2.4 测定HBV-DNA 的工作曲线及检测限
• 3.2.5 测定HBV-DNA 的选择性
• 3.3 小结
• 第四章 基于纳米金磁性微球荧光检测 HBV-DNA
• 4.1 实验部分
• 4.1.1 实验仪器与试剂
• 4.1.2 实验方法
• 4.1.2.1 纳米金磁性微球上修饰信号DNA 和连接DNA
• 4.1.2.2 涂覆亲和素的96 孔板与修饰生物素的探针DNA 的连接
• 4.1.2.3 目标DNA 的识别和修饰荧光素的信号DNA 的释放
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 实验原理讨论
• 4.2.2 生物素与亲和素结合时间的优化
• 4.2.3 探针DNA 和目标DNA 杂交时间的选择
• 4.2.4 检测HBV-DNA 的工作曲线及检测限
• 4.2.5 体系对目标DNA 的选择性
• 4.3 小结
• 第五章 利用 DNA 催化取代循环反应荧光检测凝血酶
• 5.1 实验部分
• 5.1.1 实验仪器与试剂
• 5.1.2 实验方法
• 5.1.2.1 纳米金的合成
• 5.1.2.2 纳米金上连接DNA
• 5.1.2.3 磁珠上连接适体Ⅰ与凝血酶
• 5.1.2.4 磁珠和纳米金的链接以及54 的释放
• 5.1.2.5 血浆样品的处理
• 5.1.2.6 血浆样品中凝血酶的测定
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 实验原理讨论
• 5.2.2 纳米金电镜表征
• 5.2.3 凝血酶适体和凝血酶结合的表征
• 5.2.4 S4 释放过程的表征
• 5.2.5 实验条件的优化
• 5.2.5.1 凝血酶适体Ⅰ和凝血酶结合时间的优化
• 5.2.5.2 适体Ⅱ和凝血酶结合时间的优化
• 5.2.5.3 S5 与S4 取代反应时间的优化
• 5.2.5.4 催化取代循环反应时间的优化
• 5.2.6 检测凝血酶的工作曲线
• 5.2.7 体系对凝血酶检测的选择性
• 5.2.8 血浆中凝血酶的检测
• 5.3 小结
• 第六章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表及待发表的学术论文目录