药物阻断结肠癌细胞MAPK信号通路的蛋白质组学研究

论文摘要

丝裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路的异常活化是引起结肠癌细胞增殖失控的主要原因之一,但目前对于其调控结肠癌细胞增殖的相关蛋白缺乏整体的认识,对其机理也并不明确。本论文从蛋白质组学角度出发,研究药物阻断结肠癌细胞MAPK信号通路后,结肠癌细胞蛋白质表达谱的变化,分析MAPK信号通路调节相关的靶蛋白,并初步探讨其调控结肠癌细胞增殖的机理。采用ERK信号通路抑制剂PD98059和p38信号通路抑制剂SB203580处理结肠癌细胞系HT29,通过MTT比色法测定HT29细胞的增殖活性,分析PD98059与SB203580对HT29细胞增殖的影响。结果表明PD98059和SB203580可以抑制人结肠癌细胞系HT29细胞的增殖,在一定浓度范围内对HT29细胞增殖的抑制作用具有剂量依赖性和时间依赖性。联合使用PD98059和SB203580对HT29细胞增殖的抑制具有协同作用。采用正交实验,对PD98059与SB203580的联合用药条件进行优化。确定了25μmol/L PD98059联合20μmol/L SB203580用药处理48h为抑制细胞增殖的最优条件,对HT29细胞增殖的抑制率高达（55.96±3.34）%,可以作为药物阻断细胞信号通路的蛋白质组学分析的用药条件。采用PI染色法和流式细胞术,对PD98059和SB203580对HT29细胞周期的影响进行了分析。结果表明,单独或联合使用25μmol/L PD98059和20μmol/LSB203580处理HT29细胞48 h,均能明显减少处于S期细胞的比例,增加处于G0/G1期细胞的比例。通过双向凝胶电泳,获得MAPK信号通路阻断前后的HT29细胞蛋白质组的双向电泳图谱;利用PDQuest专业图像分析软件对双向电泳图谱进行蛋白点的匹配和分析。结果表明:与对照相比,PD98059处理HT29细胞48 h后,有11个蛋白质差异表达;SB203580处理48 h后,有14个蛋白质差异表达;PD98059联合SB203580处理HT29细胞48 h后,有32个蛋白质差异表达。分析结果还表明:3个差异表达蛋白质属于ERK信号通路特异性调控的靶蛋白,7个差异表达蛋白质属于p38信号通路特异性调控的靶蛋白;同时阻断ERK和p38信号通路,对另外10个蛋白质的表达变化具有协同作用。通过MALDI-TOF-TOF串连质谱技术和生物信息学方法,对信号通路阻断前后HT29细胞差异表达的34个蛋白质点进行了鉴定,获得了全部34个蛋白质的鉴定结果。按照蛋白质的功能进行分类,可将差异表达的蛋白质分为蛋白酶体亚基、蛋白质翻译因子、转录活化因子、细胞骨架调节蛋白、分子伴侣及细胞代谢合成相关酶等六大类。综上所述,阻断MAPK信号通路可以显著抑制HT29细胞增殖,其机理主要是通过控制蛋白质的水解、蛋白质的翻译、转录和mRNA剪接、细胞骨架的动态平衡、蛋白质的折叠以及细胞代谢等过程,从而调节结肠癌细胞系HT29的增殖活性。

论文目录

• 缩写词及中英文对照
• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 前言
• 1.MAPK信号通路
• 2.蛋白质组学
• 3.本论文研究的目的和意义
• 参考文献
• 第一章 MAPK信号通路阻断剂对HT29细胞增殖的影响
• 1.材料和方法
• 2.结果
• 2.1 PD98059对HT29细胞增殖的影响
• 2.2 SB203580对HT29细胞增殖的影响
• 2.3 PD98059与SB203580联合用药对HT29细胞增殖的影响
• 2.4 PD98059和SB203580对HT29细胞周期的影响
• 3.讨论
• 4.结论
• 参考文献
• 第二章 抑制剂阻断HT29细胞MAPK信号通路的蛋白质组双向电泳图谱的获得和分析
• 1.材料和方法
• 2.结果
• 2.1 HT29细胞蛋白质组的双向凝胶电泳条件的优化
• 2.2 药物阻断MAPK信号通路前后的HT29细胞蛋白质组差异图谱
• 2.3 HT29细胞蛋白质组双向图谱差异表达蛋白点的检测分析
• 3.讨论
• 4.结论
• 参考文献
• 第三章 抑制剂阻断HT29细胞MAPK信号通路的差异表达蛋白质的鉴定
• 1.材料和方法
• 2.结果
• 2.1 差异蛋白质的肽质量指纹图谱和MS/MS图谱
• 2.2 差异蛋白质的数据库搜索和鉴定
• 2.3 部分差异表达蛋白质的mRNA水平分析
• 3.讨论
• 4.结论
• 参考文献
• 全文总结
• 附录
• 在学期间发表论文
• 致谢