原发性肝胆肿瘤nm23H1基因遗传不稳定性与临床病理特性相关性的研究

论文摘要

研究背景肝胆恶性肿瘤起病隐匿，早期缺乏典型症状，微小癌灶的浸润和转移难以及时探查和治疗，是患者生存率低的主要原因。为此，揭示肝胆肿瘤发病机制和肿瘤浸润及转移机制，寻找有效的治疗靶点和确立可靠的预后指标，是当前肿瘤的研究热点，也是肿瘤防治的关键问题之一。研究发现，随着肿瘤进展和转移的发生，肿瘤细胞内抑癌蛋白的表达量减少，逐渐失去对肿瘤细胞生长、转移的抑制，表现为肿瘤的浸润与转移。而抑癌基因的失活是编码蛋白量减少的重要机制之一。为揭示抑癌基因失活的机理，国内外针对P53、P16、FHIT等抑癌基因作了大量研究，结果表明基因的遗传不稳定性改变，其主要表型特征即微卫星不稳定性（microsatellite instablility，MSI）和杂合性缺失（loss of heterozygosity，LOH），可能是产生基因突变，导致抑癌基因功能失调，引起肿瘤发生的重要因素。微卫星是由2-6个核苷酸组成，具有高度多态性的简单串联核苷酸重复序列。MSI是指由于复制错误导致微卫星的增多或减少，使得DNA结构性等位基因的大小发生改变，目前被认为是发生肿瘤危险性可检测的指标之一。LOH是指一个位点上两个多态性的等位基因中的一个出现缺失或变异，是肿瘤细胞抑癌基因存在的标志。大量研究表明，抑癌基因MSI与LOH在肿瘤的多步骤发生过程中起着重要的作用。MSI首先是在遗传性非息肉性结直肠癌（heredity non-polyposis colorectal cancer，HNPCC）中发现的，后在各种散发性肿瘤如大肠癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌中均发现MSI。研究表明MSI的发生与DNA复制过程中的“链滑”有关，从而导致DNA序列的改变，提高了基因随机突变率，更重要的是导致了肿瘤相关基因的突变，可能是引起肿瘤发生的一个重要机制。若DNA复制错误的结果是等位基因片段的缺失，则导致LOH的发生。研究发现与抑癌基因相关的杂合性微卫星位点常伴有等位基因的丢失，即LOH的发生。所以分析LOH已成为目前检测抑癌基因失活、发现和定位新的肿瘤抑制基因的重要手段之一。nm23H1基因定位于17号染色体长臂（17q21.3），是一种重要的抑癌基因。Steeg等在对鼠黑色素瘤的研究中发现，nm23H1基因编码的蛋白产物具备核苷二磷酸激酶（NDPK）活性，可影响微管蛋白多聚化和细胞骨架形态，参与细胞分裂时纺锤体的形成和GTP介导的信号传导途径，从而影响细胞的发育、增殖、分化及运动，达到抑制肿瘤转移的目的。因此，nm23H1基因被称为“肿瘤转移抑制基因”，并对其抗肿瘤转移机理进行了大量研究。但目前多集中于nm23H1蛋白／核苷二磷酸激酶（NDPK）表达的免疫组织化学研究上，而针对有关肿瘤转移、浸润时nm23H1基因的遗传学不稳定性研究，尚鲜见报道。研究目的研究原发性恶性肝胆肿瘤中D17S396位点微卫星不稳定（microsatellite instablility，MSI）和杂合性缺失（loss of heterozygosity，LOH），对肿瘤nm23H1基因蛋白表达的影响，阐明nm23H1基因遗传不稳定性与肿瘤进展的关系，为揭示抑癌基因作用机制和肿瘤转移机理提供实验依据。研究方法（1）石蜡包埋组织抽提DNA。（2）PCR-单链构象多态性（SSCP），常规银染显示条带。（3）Envision免疫组织化学检测。（4）Leica-Qwin计算机图像分析技术。（5）SPSS软件统计分析。研究结果（1）原发性胆囊肿瘤nm23H1基因遗传不稳定性与临床病理特性的相关性研究：①在本实验中，原发性胆囊癌D17S396位点遗传不稳定发生率为42.55％，明显高于良性胆囊肿瘤的13.04％，而在胆囊炎组织中，未见该位点遗传不稳定的发生。其中，LOH的发生率，随组织恶性程度的增高而增加（P＜0.05）。在胆囊癌中，LOH和MSI发生率与肿瘤组织分化程度有关，差异具有显著性（P＜0.05）；LOH的发生率，在肝脏浸润组和淋巴转移组高于无肝脏浸润组和无淋巴转移组，在NevinⅣ+Ⅴ期高于Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ期（P＜0.01）；而MSI发生率则相反。②nm23H1蛋白阳性率在胆囊癌、胆囊良性肿瘤和炎症组织中分别为46.81％、26.09％和10％（P＜0.05），在胆囊癌中，nm23H1蛋白阳性率在淋巴转移组低于无淋巴转移组（P＜0.01）；NevinⅣ+Ⅴ期低于Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ期（P＜0.05）。此外，计算机图像定量分析显示，在各临床病理参数影响下，nm23H1蛋白的表达强度没有差异。③在胆囊癌中，LOH阳性组中nm23H1蛋白阳性率为11.11％，显著低于LOH阴性组的55.26％，两者差异显著（P＜0.05）。（2）肝细胞癌nm23H1基因遗传不稳定性与临床病理特性的相关性研究：①48例肝细胞癌D17S396位点遗传不稳定性的发生率为35.42％。LOH的发生率在有无淋巴结或远处转移和有无肝内转移或门静脉栓的癌组织中有显著差异（P＜0.01），临床TNM分期Ⅲ期LOH的发生率显著高于Ⅰ、Ⅱ期（P＜0.01）。此外，在侵袭转移高危组LOH的发生率显著高于侵袭转移低危组（P＜0.01）。MSI检出率与肝细胞癌临床病理参数均无关。②nm23H1蛋白阳性率为56.25％，nm23H1蛋白阳性率在Edmondson分级Ⅲ+Ⅳ组低于Ⅰ+Ⅱ组（P＜0.01），在有淋巴或远处转移组显著低于无淋巴或远处转移组（P＜0.01），TNM分期Ⅲ期显著低于Ⅰ+Ⅱ期（P＜0.01）；在侵袭转移高危组中nm23H1蛋白阳性率显著低于侵袭转移低危组（P＜0.01）。此外，计算机图像定量分析显示，在各临床病理参数影响下，nm23H1蛋白的表达强度没有差异。③LOH阳性组中nm23H1蛋白阳性率为27.27％，显著低于LOH阴性组64.86％，两者差异显著（P＜0.05）。结论nm23H1基因的遗传不稳定性可能是肝胆肿瘤发生、发展的一个重要机制。nm23H1基因LOH的发生多在肝细胞癌、胆囊癌的晚期阶段，可作为肝胆组织恶变的判断指标；MSI和LOH通过相互独立的途径调控肝胆肿瘤的发生和转移；后者可抑制肝胆肿瘤局部nm23H1蛋白的阳性表达，并赋予肝胆肿瘤高淋巴结转移、低预后的特性；提高肝胆肿瘤局部nm23H1蛋白的阳性表达，可减缓肿瘤的浸润转移并改善患者预后。

论文目录

• 一、英文缩略词
• 二、中文摘要
• 三、英文摘要
• 四、正文
• 前言
• 材料与方法
• 结果（胆囊肿瘤）
• 结果（肝肿瘤）
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 五、综述
• 人类错配修复基因在消化道肿瘤发生中的作用研究新进展
• 六、已发表和待发表文章
• （一） 中国人原发性胆囊肿瘤nm23H1基因遗传不稳定性的研究分子细胞生物学报,2006,39（3）:249-257
• 七、致谢